食管癌组织hMSH2mRNA的表达和启动子区甲基化

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1、食管癌组织hMSH2mRNA的表达和启动子区甲基化作者：张功员刘秋亮乐晓萍丁一张钦宪【摘要】　　目的：检测食管癌组织中hMSH2mRNA的表达和启动子区甲基化异常.方法：食管癌标本及相应正常食管黏膜组织32例.原位杂交法检测hMSH2mRNA的表达，甲基化特异PCR（MSP）法检测错配修复基因hMSH2启动子区甲基化.结果：食管癌组织中hMSH2mRNA阳性表达率为46.9%，正常组织为84.4%（P<0.05）.hMSH2mRNA阳性表达率与食管癌患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、病理类型、组织学分级、淋巴结转移、浸润深度等均无关（P>0.05）.食管癌组织中hMSH2启动

2、子区甲基化发生率为34.4%，正常食管黏膜组织未发现甲基化，2组甲基化阳性率相比较差异有统计学意义（P<0.01）；高龄患者（≥70岁）癌组织中hMSH2启动子区甲基化发生率（85.7％）明显高于较低龄患者（<70岁）(20.0％)(P<0.05)；病理组织学Ⅲ,Ⅳ级食管癌组织中hMSH2启动子区甲基化发生率（70.0%）高于Ⅰ,Ⅱ级（18.2%）（P<0.05）.食管癌组织中hMSH2mRNA阳性组启动子区甲基化的发生率（13.3%）低于hMSH2mRNA表达阴性组（53.0%）（P<0.05）.7结论：hMSH2的表达缺失是食管癌发生的早期事件；食管癌组织

3、中hMSH2基因启动子区甲基化与患者年龄和肿瘤病理类型可能有关；hMSH2基因的失活与其甲基化有一定关系.【关键词】食管肿瘤hMSH2基因mRNA甲基化0引言中国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家，而河南林县及其相邻的辉县、安阳等地是我国也是世界上食管癌发病率和死亡率最高的地区［1］.我们应用原位杂交方法，检测了食管癌和正常食管组织中错配修复基因hMSH2mRNA的表达，并结合患者的临床病理资料进行分析；应用甲基化特异PCR（MSP）方法检测食管癌组织中hMSH2基因启动子区的甲基化状态，探讨了其与食管癌发生、发展的关系.1对象和方法1.1对象食管癌患者32(男19，女13)例，年龄5

4、0~78(62.8±7.4)岁.术前均未接受放化疗.取其手术切除癌标本及相应正常食管黏膜组织，全部手术切除标本均经2位以上病理学专家诊断证实.其中鳞癌25例，腺癌5例，腺鳞癌2例；组织学Ⅰ,Ⅱ级22例，Ⅲ,Ⅳ级10例；无淋巴结转移23例，有淋巴结转移9例；食管上段癌4例，中段癌16例，下段癌12例；肿瘤最大直径<5cm17例，≥5cm15例；浸润至黏膜1例，浸润至肌层18例，浸润至全层13例.732例标本均于切除后0.5h内，在癌灶及正常残端取约1cm×1cm×1cm大小的组织块2份，一份40g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋；另一份提取DNA.1.2方法原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工

5、程有限公司.所有操作均按说明书进行［2］.标本采用蛋白酶Ｋ消化，酚／氯仿／异戊醇抽提，乙醇沉淀的经典方法提取ＤＮＡ.应用CpGenomeDNAModificationKit(Intergen)试剂盒修饰DNA.PCR扩增参照文献［3］设计针对hMSH2启动子去甲基化和甲基化的特异性引物.hMSH2去甲基化引物序列为：5′GGTTGTTGTGGTTGGATGTTGTTT３′（正义），5′CAACTACAACATCTCCTTCAACTACACCA３′（反义），产物长度151bp；甲基化引物序列为：5′TCGTGGTCGGACGTCGTTC３′（正义）,5′CAACGTCTCCTT

6、CGACTACACCG３′（反义），产物长度150bp.反应总体积50μL，反应体系为10×PCRbuffer(Mg2+plus)(Takara)5μL,2.5mmol/LdNTP(TaKaRa)4μL，20μmol/L引物(Sangon)各1μL,修饰后DNA模板2μL，83.35mkat/LTaqDNA聚合酶（Takara）0.5μL,循环参数：95℃变性5min,95℃50s,58℃(去甲基化)／56℃（甲基化）50s,72℃50s,循环36次，最后72℃延伸5min.原位杂交染色后DAB试剂盒进行最终的反应，镜下观察，以细胞胞质有棕色颗粒出现为阳性表达，胞质无着色为阴性表达.PC

7、R产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳，EB染色，溴乙锭紫外灯下观察结果并记录.7统计学处理:组间比较计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验或Fishers精确概率计算,P<0.05为差异有统计学意义.2结果2.1食管癌组织中hMSH2mRNA的表达阳性表达细胞主要是黏膜腺体的腺细胞，在细胞间质中有散在阳性细胞，阳性表达均在细胞胞质.食管癌和正常食管黏膜组织中hMSH2mRNA的阳性表达率分别是46.9%，84.4%