人热休克蛋白72基因的克隆、原核表达与纯化

人热休克蛋白72基因的克隆、原核表达与纯化

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1、人热休克蛋白72基因的克隆、原核表达与纯化作者:余厚友 宋祖军 袁顺书 刘彦仿 杨守京【关键词】肝肿瘤关键词:肝肿瘤;细胞株;热休克蛋白72;克隆;基因表达摘要:目的克隆人热休克蛋白72(HSP72)基因,原核表达并纯化蛋白产物,以探讨其生物学功能.方法从热休克的人肝癌细胞株SMMC-7721中,用RT-PCR方法扩增得到HSP72基因并克隆到原核表达载体pQE-30中,在大肠杆菌JM109中用IPTG诱导下表达的蛋白经FPLC梯度洗脱和SephacrylS200凝胶过滤纯化,经SDS-PAGE电泳后转印到NC膜上,用anti-HSP72单抗作探针,进行Weste

2、rnblot鉴定.结果克隆的基因序列分析结果与有关报道一致,所构建的pQE-30HSP72载体在大肠杆菌中表达出与预期大小相符的Mr为72000的蛋白,经鉴定确系HSP72蛋白.结论克隆了人HSP72基因,并对该基因进行了原核表达与纯化,为进一步研究其生物学功能奠定了良好基础.  Keywords:liverneoplasms;cellline;heatshockprotein72;cloning;geneexpression  Abstract:AIMToclonehumanheatshockprotein72(HSP72)gene,doprokaryotice

3、xpressionandpurifyHSP72protein9forfurtherstudy.METHODSHumanHSP72genewasobtainedbyRT-PCRfromheatshockedhumanhepato-carcinomacelllineSMMC-7721.ItsproductwasrecombinedinvitrowithprokaryoticexpressionvectorpQE-30andwas transformedtoE.colistrainJM109.Theproteins,expressedinE.colistrainwith

4、HSP72recombinantplasmidunderIPTGinduction,wasobtainedbyFPLCandSephacrylS200chro-matographyandcharacterizedbySDS-PAGEandWestern-blot-confirmedwithanti-HSP72McAb.RESULTSTheHSP72genewasclonedandidentifiedtobeconsistentwithrelevantreports.TheHSP72withamolecularweightof72000washighlyexpres

5、sedinpQE-30HSP72.WesternblotprovedthattheexpressedproducthadtheantigenicityofHSP72.CONCLUSIONTheestablishmentofaseriesofmethodsforthecloning,expressionandpurificationofHSP72genewillassistinthestructuralandfunctionalchar-acterizationofHSP72.  0引言9  热休克蛋白(HSP)是生物体(或离体的培养细胞)在不良环境因素作用下(如缺

6、血、缺氧、重金属离子、氨基酸类似物、病毒感染、DNA损伤等)所产生的一组特殊蛋白质,对细胞损伤有保护作用.其生物学功能很广泛,在细胞生长、发育、分化过程中参与基因转录、蛋白质合成、折叠、跨膜运输、分解和立体构象的维持并发挥重要作用,属分子伴侣蛋白[1].热休克蛋白72(HSP72)是HSP中最保守和最主要的一类.近年来发现很多疾病的发生、发展均与其有关,有必要进一步了解其生物学功能.我们克隆了人HSP72基因,并在大肠杆菌内对该基因进行了诱导表达,建立了一套完备的纯化方法,为进一步研究提供了条件.  1材料和方法  1.1材料人肝癌细胞株SMMC-7721和受体菌

7、JM109由本室保存.测序质粒载体pUC19和原核表达质粒pQE-30由中山医科大学叶苓博士惠赠.EcoRI,PstI,T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶购自NSBCSangon公司.DNAMarker、蛋白质相对分子质量标准和anti-HSP72单抗购自Gibco公司.IPTG、细胞总RNA提取试剂盒和质粒提取纯化试剂盒为Promega公司产品.cDNA第一链合成试剂盒购于华美生物公司.  1.2方法  1.2.1PCR引物的设计根据GeneBank中已报道的人HSP72基因序列,设计了一对PCR扩增引物,并在片段的5’及3’端序列引入HSP72基因内部没有的

8、新的酶切位

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