人脐带间充质干细胞诱导为脂肪细胞的研究

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1、万方数据分类号：Q291密级：学位类别：科学学位囹专业学他口0学校代码：1062学号：2010702004学科门类：医学又肄普科史垮了IANJINM￡OICALUNlVERSll广Y硕士学位论文Ⅳ【ASTER’SDISSERI’ATION论文题目：人脐带间充质干细胞诱导为脂肪细胞的研究TITLEStudiesonInducingHumanUmbilicalCordMesenchymalStemCellstoDifferentiateintoAdipocyte一级学科：基础医学二级学科：病原生物学论文作者：刘忻锐指导教师：汤华教授导师组成员：刘民教授天津医科大学研究生

2、院二。一四年五月万方数据学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作耿得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：立衅址日期：训II午，月fb同学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家

3、有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在——年解密后适用本授权书。本论文属于不保密囵。(请在相对应的方框内打“√”)学位论文作者签名：导师签名：同期：州眸媚16RFt期：珈f够年明16日万方数据天津医科大学硕十学位论文中文捅要研究目的：问充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)是一类较原始的干细胞，具有高度增殖性和多向分化潜能。目i仃研究较多的是骨髓间充质干细胞，而脐带问充质干细胞近几年才被人们重视并加以研究。与骨髓问充质干细胞相比，脐带间充质干细胞不仅具有相似的增殖特性及多向分化潜能，而且具有取材方便、来源广泛、免疫原性更低等优势，

4、这是其成为近年来干细胞研究领域中的热点。本研究建立了分离纯化人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcell，hUC．MSC)的方法，并对其表面标志进行了鉴定。同时研究间充质干细胞向脂肪细胞的诱导分化，并探讨其分化过程中miRNA．27a和miRNA．143的表达，为阐述间充质干细胞脂向分化的调控机制提供了新的思路，并有一定的临床应用价值。研究方法：在严格无菌条件下，采集健康足月胎儿的脐带组织，采用酶消化法和组织块贴壁法进行原代细胞分离培养，通过流式细胞仪对其表面标记进行检测。将原代细胞进行传代培养，并将第5代间充质干细

5、胞经IBMX、胰岛素、吲哚美辛和地塞米松联合使用进行脂向诱导。利用油红0免疫组化染色的方法鉴定分化后的细胞，使用实时荧光定量PCR技术比较间充质干细胞和脂肪细胞中miRNA．27a和miRNA．143以及它们靶基因的表达。随后分析miRNA一27a和miRNA．143以及它们对应靶基因的变化趋势。研究结果：分离纯化后的hUC．MSCs呈均匀有序的成纤维细胞形态。脐带酶消化法培养的细胞2．3天可见成纤维样细胞，3．5天后在倒置显微镜下可见散在分布的细胞集落，贴壁后的细胞增殖速度较快，原代细胞培养5天后可见大量细胞，融合度达80％。使用组织块培养法，5．7天可见脐带组织

6、块周围有细胞爬出，爬出的细胞随后贴壁生长，呈短粗梭型或多角形。贴壁后的细胞增殖速度快，2周左右细胞可达80．90％融合。两种方法下，当细胞达到80．90％的融合度时，按1：3的比例进行传代，传代后细胞生长3-6小时便可贴壁，最初为短粗的梭形或者卵圆形，24小时后细胞变为长梭形或多边形，细胞均匀分布，平行排列生长或旋涡状生长，约3天可达到80％融合。取第5代脐带l’白J充质干细胞进行流式细胞术检测细胞表面标记物，结果显示hUC．MSCs高表达CD44、CD73、CDl05、CDl66、HL气一ABC，不表达CD34、CDl06，符合问充质干细胞的生物学特性。在将其定向

7、诱导为脂肪细胞的过程中，利用吲哚美辛、地塞米松、胰万方数据天津医科大学硕十学位论文岛素以及3．异丁基．1．甲基黄嘌呤四种诱导剂可以使脐带问充质干细胞分化为脂肪细胞的效率达到90％以上，且绝大多数为油红0染色阳性的成熟脂肪细胞。利用实时荧光定量PCR检测证实miRNA．27a在MSCs脂向分化的过程中显著下调(0．0095±0．002vsl±0．03)；miRNA．143的相对表达量则显著上调(17．81±0．88vsl±0．004)。结论：该研究证实采用酶消化法和组织块法均能分离得到人脐带间充质干细胞，且均具有高度的增殖能力，流式细胞仪检测符合间充质干细胞的生物