pparγ保护原代皮层神经元过氧化氢损伤的研究

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1、分类号：R741学校代码：10062密级：学号：2012602701硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：PPARγ保护原代皮层神经元过氧化氢损伤的研究TITLEStudyontheprotectiveeffectsofPPARγagainsthydrogenperoxide-inducedinjuryinprimaryculturedcorticalneurons一级学科：临床医学二级学科：神经病学论文作者：王宁指导教师：孙莉副研究员天津医科大学研究生院二〇一五年五月分类号：R741学校代码：10062密级：学号：

2、2012602701学位类别：科学学位学科门类：医学硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：PPARγ保护原代皮层神经元过氧化氢损伤的研究TITLEStudyontheprotectiveeffectsofPPARγagainsthydrogenperoxide-inducedinjuryinprimaryculturedcorticalneurons一级学科：临床医学二级学科：神经病学论文作者：王宁指导教师：孙莉副研究员天津医科大学研究生院二〇一五年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下

3、独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属

4、于不保密。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日天津医科大学硕士学位论文中文摘要研究目的：观察过氧化氢（H2O2）诱导的体外原代培养皮层神经元损伤中，过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）的表达及活性改变，以及PPAR激活或抑制对神经元过氧化氢损伤产生的影响，探讨PPAR对神经元氧化应激损伤的保护作用。实验方法：1、原代培养皮层神经元：取出生24h之内Sprague-Dawley新生鼠皮层神经元细胞进行体外原代培养，培养7天（d7）进行纯度鉴定，并用于各种处理和检测。2、神经元过氧化氢损伤

5、模型：以不同浓度的过氧化氢作用于d7神经元，于不同作用时间后进行评价，选取合适浓度及作用时间应用于后续实验。3、细胞形态学观察：包括光镜下观察，即将不同组别细胞置于将倒置相差显微镜下，观察其形态变化，并采集图像；神经元MAP2免疫荧光染色，即用MAP2抗体标记神经元，荧光显微镜下观察不同组别细胞形态完整性的改变，并采集图像。4、MTT比色法检测细胞相对存活率，即检测不同组别神经元经处理后细胞活性的改变。5、分别提取总蛋白和核蛋白，Westernblotting法检测不同组别细胞内PPARγ、p-PPARγ（磷酸化PPARγ）、p-ERK1/

6、2（磷酸化ERK1/2，即ERK1/2的活性形式）、Bcl-2、活化的Caspase-3、Nrf2的表达水平。6、qRT-PCR法观察PPARγ靶基因：提取不同组别神经元RNA，qRT-PCR技术对PPARγ靶基因表达水平进行检测。7、ELISA法检测PPARγ-DNA结合活性：应用PPARγ转录因子分析试剂盒检测不同组别神经元PPARγ与过氧化物酶体增殖物反应元件（PPRE）的结合活性。8、反义寡核苷酸法降低神经元PPARγ：用PPARγ反义寡核苷酸处理原代培养d7神经元细胞，抑制PPARγ表达。实验结果：I天津医科大学硕士学位论文1、体

7、外培养正常皮层神经元2d后，大多细胞呈圆形或椭圆形，可见较细小的细胞突起，至第7天时神经元胞体立体感强，形态饱满，突起变长且增粗，并相互交织成网。用神经元特异性抗体微管相关蛋白2（MAP2）对进行免疫荧光染色，鉴定神经元阳性率达95%以上，是相对纯的神经元培养，可用于后续实验。2、将过氧化氢作用于神经元，可造成神经元损伤，轻者细胞肿胀变圆，细胞突起断裂或消失；重者细胞发生崩解，可见较多细胞碎片，并呈现剂量-时程依赖效应。选取浓度为500M、作用6~24小时进行后续实验。3、过氧化氢抑制神经元PPAR蛋白表达，同时增加PPAR灭活；抑制

8、ERK1/2激活可以拮抗过氧化氢对PPAR的灭活作用。4、外源性给予PPAR激动剂罗格列酮减轻神经元过氧化氢损伤、增加Bcl-2及Nrf2表达，同时抑制活化的Caspase-