大鼠皮层神经元原代培养、鉴定及氧糖剥夺模型的建立

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1、大鼠皮层神经元原代培养、鉴定及氧糖剥夺模型的建立作者：莽靖李昕华阎世军何金婷邢影邵延坤徐忠信【摘要】目的原代培养和鉴定大鼠皮层神经元，并建立大鼠皮层神经元氧糖剥夺（OGD）模型。方法采用酶消化法和机械分离法相结合进行大鼠神经元原代培养，采用抗NSE免疫细胞化学染色鉴定，应用缺氧DHank液及缺氧培养罐行OGD，台盼蓝染色及LDH漏出率检测细胞损伤程度。结果神经元培养至第6天，NSE染色阳性细胞为86.32%±2.64%；神经元经不同时长的OGD处理后，台盼蓝染色呈现不同形态；OGD60min时，神经元LDH漏出率较对照组明显增加（P<0.05）。结论成功完成大鼠皮质神经元原代培养，神经

2、元在培养第6天可用于模型制备，成功建立神经元OGD模型。【关键词】神经元；原代培养；氧糖剥夺　　体外细胞培养是神经科学研究重要的方法。中枢神经系统对缺血缺氧极其敏感，缺血缺氧性脑损伤是缺血性脑血管病的基础病理过程〔1～3〕。本实验采用大鼠皮层神经元原代培养，应用体外氧糖剥夺（oxygenglucose7deprivation，OGD）建立大鼠脑皮层神经元缺血缺氧损伤模型，模拟体内脑缺血过程，对进一步探讨缺血缺氧过程中神经元的病理及病理生理变化，研究其脑损伤的机制，探索新的治疗靶点具有重要意义。　　1材料与方法　　1.1大鼠皮层神经元原代培养　　出生12h内的Wistar乳鼠，用于皮层神经元原

3、代培养。购自吉林大学动物实验中心。采用酶消化法和机械分离法相结合培养神经元。分离出Wistar鼠皮层组织，剪碎后加入0.125%的胰酶，在37℃，5％CO2培养箱消化、震荡，形成细胞悬液后接种培养，6d后进行鉴定。　　1.2大鼠皮层神经元鉴定　　①细胞培养板每日置于倒置显微镜下观察细胞胞体与突起形态、贴壁与生长情况。②神经元在培养第6天用特异性烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染色进行鉴定，显微镜下观察，以在细胞膜和胞浆内出现棕黄色颗粒者判定为阳性，每张爬片随机选取3个200倍视野，计数，取均值，计算阳性细胞百分比。　　1.3体外培养神经元OGD模型的建立7　　①缺氧DHank液制备。利用自行设

4、计生产的组装瓶将DHank液通入含95%N2及5%CO2的缺氧气体，制备缺氧DHank液，用血气分析仪测定缺氧DHank液的氧浓度。②缺氧罐的制作及应用。将真空干燥器通入缺氧气体制成缺氧罐，用麻醉气体分析仪测定缺氧罐内氧含量。③神经细胞OGD模型的建立。将培养第6天的神经元用缺氧DHank液孵育，并放入缺氧罐中，将缺氧罐放入37℃孵箱内开始计时；分别取缺氧时间为15、30、45、60、90、120、180min再复氧24h的神经元进行评价。　　1.4体外培养神经元OGD模型的评价　　①台盼蓝染色法测定细胞死亡率。测定时取出培养板，每个时间点取3孔，吸弃上清液，然后加一滴0.4%台盼蓝溶

5、液，在3min内随机计数200个细胞中蓝染的死细胞及未蓝染活细胞的细胞数，计算细胞死亡率。②LDH漏出率的检测。将待测细胞培养板取出，每组每个时间点取3孔，吸取各孔内的培养液入相应试管内，加入等量PBS液，制备成细胞匀浆液，收集入相应的试管内。每孔液体设2个试管，分别测定细胞培养液和细胞匀浆液的OD值。按公式计算LDH漏出率。　　1.5统计学处理　　数据以x±s表示，应用SPSS16.0软件进行方差分析。7　　2结果　　2.1大鼠皮层神经元原代培养及鉴定　　神经元在培养第6天分化成熟，可见细胞散在生长，胞体小，折光性强，形成密集的神经细胞网络。培养第6天，可见大部分细胞染成棕黄色，NSE阳性细

6、胞占全部细胞的百分比的86.32%±2.64%，见图1。　　2.2缺氧DHank液体氧浓度及缺氧罐氧含量　　缺氧DHank液体的氧浓度低于1%，缺氧罐内氧含量为1%±0.1%，二氧化碳浓度为5%±0.1%。　　2.3神经元不同OGD时间细胞死亡率　　神经元OGD15、30min，所有细胞均未受损伤；45、60min少部分神经元蓝染，细胞死亡率为15.00%±2.50%、22.17%±1.04%；90、120min使神经元出现皱缩，胞浆空泡明显，突起缩短、断裂，胞浆空泡明显，蓝染细胞增多，细胞死亡率为40.67%±2.08%、56.00%±2.17%；180min使神经元轮廓模糊，全部蓝染，

7、细胞死亡率为97.17%±1.89%。7　　2.4LDH漏出率检测　　随OGD时间增加，神经元LDH漏出率逐渐增加，其中神经元OGD45min时LDH漏出率开始明显增加（P<0.05）。见图2。　　3讨论　　体外细胞培养已被广泛应用于神经细胞分子生物学研究。本研究采用酶消化法和机械分离法相结合成功进行体外神经元原代培养并通过NSE免疫细胞化学染色进行鉴定。NSE是一种酸性可溶性蛋白质，是神经