利用lyr基因建立大豆安全筛选标记体系的研究

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1、分类号：Q785单位代码：10193密级：公开学号：2012072硕士学位论文利用Lyr基因建立大豆安全筛选标记体系的研究EstablishmentofsafetyselectionmarkersystemforsoybeanbyLyrgene作者姓名：靳京学位类别：农学硕士专业名称：作物生物技术研究方向：植物抗逆分子生物学与基因工程指导教师：李海燕所在学院：生命科学学院2015年5月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下,独立进行研究所取得的成果。尽我所知,除文中特别加以标注和致谢所列内容外,论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果,也

2、不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处,本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定,即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有,并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学,学校有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意

3、/不同意,务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果,必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要大豆(Glycinemax)作为全球重要的油料作物，对全世界的社会效益与经济效益有着至关重要的作用，因此，对其产量的需求越来越大。科研工作者们通过利用转基因技术培育出抗虫、抗旱、高产等新品系转基因大豆，以满足社会对大豆产量的需求。然而，在转基因食品带

4、来更好效益的同时，转基因植株中基于抗生素和除草剂的筛选标记基因的使用越来越引起人们对生态安全以及食品安全问题的担忧。由此，无选择标记转基因植物的培育显得尤为重要。赖氨酸消旋酶(Lysineracemase，Lyr)存在于土壤微生物中，它催化L-型赖氨酸(L-Lys)和D-型赖氨酸(D-L-Lys)之间的相互转化，野生型植物细胞对L-Lys敏感,但D-Lys却促进了它们的生长，转入Lyr基因的植株可在含有L-Lys与琼脂的培养基上正常生长，未转化植株则生长受到抑制。本研究利用Lyr基因建立大豆安全筛选标记体系，构建Lyr基因与Bar基因并存的双基因标记植物表达载体pBas

5、ta-Lyr，利用农杆菌介导法转化大豆子叶节，并且以赖氨酸、Basta为筛选标记,确定在生芽培养基中赖氨酸的筛选压，进一步比较两种标记下转基因大豆在适当筛选压下筛选效率、生长状态以及转化率，为应用Lyr基因作为安全选择标记基因提供可靠理论依据。研究结果如下：1、合成Lyr基因并重组到pBasta质粒中，具有L-型赖氨酸(L-Lysine，L-Lys)和Basta作为筛选标记的双标记植物表达载体pBasta-Lyr，并将该质粒转入农杆菌EHA105菌株中用于大豆转化。2、通过多次重复,统计生芽培养基(SI)中不同L-Lys浓度下大豆子叶节的芽再生率，确定了两个品种的大豆（

6、吉育72、威廉姆斯82）在SI培养基中L-Lys的筛选压。结果表明两种大豆品种子叶节几乎全部死亡的赖氨酸筛选压分别是吉育72：16mM；威廉姆斯82：22mM。3、利用含有pBasta-Lyr质粒的农杆菌，通过农杆菌介导法侵染转化大豆（吉育72、威廉姆斯82），并分别以L-Lys和Basta为选择剂筛选转化植株。结果表明，大豆品种相同，以L-Lys为筛选剂比Basta为筛选剂抗性芽再生率高4%；在SE培养基中，利用L-Lys筛选的抗性苗较用Basta筛选的抗性苗生长旺盛，根系较发达，株茎较粗壮。4、通过PCR技术鉴定T0代、T1代转化植株获得相应的转化率。T0代吉育72

7、：L-Lys筛选植株转化率4.33%，Basta筛选植株转化率3.17%；威廉姆斯82：L-Lys筛选植株转化率5.33%，Basta筛选植株转化率0.83%。T1代吉育72：L-Lys筛选植株转化率1.50%，Basta筛选植株转化率0.67%；威廉姆斯82：L-Lys筛选植株转化率1.50%，Basta筛选植株转化率0.17%。对部分T2代转化植株进行PCR及Southernblot杂交检测进一步比较两筛选体系差异。证明L-Lys筛选标记体系优于Basta筛选标记体系，为大豆转基因技术中有关选择标记安全问题提供借鉴。关键词：转基因大豆