利用特异性整合酶建立无筛选标记的转lacs基因奶牛细胞系

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2、ｉｓｈｍｅｎｔｏｆＭａｒｋｅｒｆｒｅｅＬａｃＳＧｅｎｅＴｒａｎｓｉｌｌＬｉｇ；；ＵｓｉｎｇＳｅｃｉｆｉｃＩｎｔｅｒａｓｅｐｇ’、Ｖｉ－？．■■、＇．＇，，．，‘一．寻、．、，、．＊．—？‘Ｍ＇Ｖ‘叩一＇＾件．申请人：固涛—、■－，＾ｒ＾１学科ｎ类：理学学科专业：发育生物学研究方向：动物发育生物学与胚胎工程：严．＾指导教师：周欢敏教授今＼其．‘．。－＇．．＇六Ｖ一．．诛：，广■．．户＊ｔ＞－．．．、．＇－．‘，、■Ｖ■一＇、Ｖ

3、＇Ｗ；。－：；：论文提交日期：二五年六月，章〇是，－，－＼Ｖ．．．＇：电發’、＊．’、‘、．ｙＬ！．Ａ三ｋ；一内蒙古农业大学研究生学位论文独创声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的硏究工作，除了文中特别加标注和致谢的地方外及取得的研究成果。据我所知，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料一，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。一切相关责住申请学位论文与资料若有不实么处，本人承担。论文作者签

4、名；罔请日期：２ｏｉｋ．Ｌｉ内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，目Ｐ：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业大学。学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子文档，允。学校可公布学位论文的全部或部分内容许论文被查阅和借阅（保密内容除外），采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名；罔寺焉指导教师签名：ｉ教、赵日期：茲

5、位摘要转基因动物是生物学研巧领域的重要材料，筛选标记基因被广泛应用于转基因动物的生产过程中，然而筛选标记的残留存在生物安全隐患ｏｘ。利用Ｃｒｅ／Ｌｐ重组系统ＥＧＦＰ－－ＬａｃＳ载体可实现删除筛选标记基因的目的Ｎｌ，通过电转。本实验构建了ｐ染方法使该载体与体外转录所得的ｐｈｉＣ３１整合酶ｍＲＮＡ共同转染了奶牛胎儿皮肤成纤维细胞，使ＬａｃＳ基因定点整合入奶牛胎儿皮肤成纤维细胞基因组上，筛选出稳定转染的表达绿色受光的阳性细胞株。再利用Ｃｒｅ穿腹庶对表达绿色受光的阳性细胞进行僻育，切除筛选标记基因，获得稳定转染的无绿色受光的细胞系，为培育无筛选标记基

6、因的转ＬａｃＳ基因克隆奶牛奠定基础。主要结果概括如下：－ＮｔＢＧＦＰｌ为骨架载体ａａｃＳｐＥ，将合成的序列和优化的Ｌ基因克隆入ＧＦＰ－Ｎｌ置利用ＰＣＲ引物添加同方向的两个ＬｏｘｐＥ，并在相应位ｐ序列，构建了真核－ＥＧＦＰ－－ＬａｃＳ表达载体ｐＮｌ。２－－－．将ＰＥ畑ＰＮｌＬａｃＳ质粒和ｐｈ把３１整合酶ｍＲＮＡ通过电转染的方法共转染奶牛胎儿皮肤成纤维细胞，使目的基因定点整合入奶牛基因组，经过４００ｌ／ｍＬＧ４１８筛选＾ｇ出表达绿色受光的细胞系。义将Ｔ－２８ａ－Ｈｉｓ－ＮＬＳ－ＴＡＴ－Ｃｒｅ质粒转化ＢＬ２１（Ｄ巧阳）感受态细胞并诱导表（）达Ｃｒｅ重

7、组蛋白，经过纯化得到Ｃｒｅ穿膜肤，利用Ｃｒｅ穿膜肢对表达绿色夷光的细胞株进行３７Ｃ麟育，切除标记基因。筛选出去除筛选标记基因的无绿色受光的细胞系，即得到可定点整合并且无筛选标记转ＬａｃＳ的奶牛细胞系。关键词：Ｃｒｅ／Ｌｏｘｐ重组系统；筛选标记；ＬａｃＳ基因；定点整合；Ｃｒｅ穿膜肤Ｅｌｉｈｍｅｎｆ－ｎｅｓｔａｂｓｔｏＭａｒｋｅｒｆｒｅｅＬａｃＳＧｅＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＣｏｗＣｅｌｌＬｉｎｅｓＵｓｉｎｇＳｅｃｉｆｉｃＩｎｔｅｒａｓｅ