胡萝卜高效再生体系的建立和内参基因的筛选

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1、万方数据擀”‘4娄胡萝l、高效再生体系的建立和内参基因的筛选摘要胡萝卜(DaucuscarrotL．)为伞形科植物，是世界上最重要的蔬菜作物之一。胡萝卜是组织培养研究中的经典材料，非常适于作为农杆菌转化系统的转基因受体。有关农杆菌介导的胡萝卜遗传转化体系自1987年以来已有陆续报道，采取的外植体类型包括子叶、下胚轴、肉质根等。本实验目的之一是建立一个高效率的胡萝卜再生体系，为下一步构建胡萝卜农杆菌转化体系，进而通过转基因技术提高胡萝卜品质及品种改良奠定基础。非生物胁迫是导致胡萝卜减产的重要因素。基因表达量的检测是对胁迫相关基因进行功能研究的一个重要方面。在进行基因表达分析之前，需要对候选内参

2、基因的表达稳定性进行评价和验证。但目前还没有在非生物胁迫以及激素处理条件下对胡萝卜内参基因进行系统筛选的报道。本实验的目的是筛选出不同非生物胁迫和不同激素处理条件下最适内参基因及其数目，从而为未来更好地在胡萝卜基因表达研究中标准化和定量分析转录水平奠定基础。本试验建立的高效胡萝卜愈伤组织诱导和再生植株体系，是以胡萝卜品种‘君川红’的无菌苗下胚轴为材料，研究不同培养基时其愈伤组织诱导的影响。具体研究结果如下：胡萝卜种子在％MS培养基培养出无菌苗，种子利用20％NaCIO消毒45lain效果最好；胡萝卜愈伤组织诱导的过程为暗培养，诱导时间为30d．筛选所得培养基为B5+0．5mg／L6-BA+0

3、．8mg／L2，4一D和B5+1．0mg／L6-BA+0．6mg／L2，4-D两个配比时，愈伤诱导率为百分之百，愈伤分化率最高；将愈伤组织的分化芽切下直接转移到B5培养基上，全部分化芽均能生根并继续正常生长；待植株形成根系并长出6~7片叶时，转入玻璃试管中壮苗。壮苗约2周时间，观察直立、生长旺盛的植株洗去培养基后栽种在装有土的盆钵中，进行常规栽培管理，再生苗的成活率较高．本实验从胡萝卜品种‘黑田五寸’中克隆出9个候选内参基因片段(GAPDH、ACTlN、eIF-4a、删、SAND、TIP41、珊Q、EF-la和TUB)。8周大的胡萝卜植株经受非生物胁迫(高温、低温、盐害和干旱)和激素处理(赤

4、霉素、水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸)。取处理后植株叶作为实验材料，用于实时定量PCR。利用BestKecper、geNorm和NormFinder-软4q-，对候选内参基因3个生物和技术重复的qFCR数据进行了分析，最终筛选出不同非生物胁迫和不同激素处理条件下最适胡萝卜内参万方数据胡萝卜高效再生体系建立和内参基因的筛选基因。为了进一步辩正在本研究中确定的内参基因的适宜性，还对DcDREB-A1基因(拟南芥的．4tDREB-A1基因同系物)在胡萝卜高温胁迫下的表达谱进行了研究。上述胡萝卜内参基因筛选具体研究结果如下：1．以胡萝卜品种‘黑田五寸’叶eDNA为模板，对9个候选内参基因(GAPDH．A

5、CTlN．枷乳钮．PP材．SAND．TIP41，UBQ。EF-la和TUB)进行克隆．BLAST分析表明，9个候选内参基因与其他物种的同源基因碱基相似性大部分在80％以上．内参基因的高度保守性进一步表明实验结果是准确的．2．单胁迫处理：ACTIN和TUB，并在elF-4a或者SAND中选取1个基因，是高温胁迫下最佳内参基因组合；ACTlN或GAPDH中选取1个基因，与UBQ是低温胁迫下最佳内参基因组合；ACTIN与TUB或GAPDH被推荐为干旱胁迫处理下最适内参基因组合；GAPDH与elF-4a和UBQ选为赤霉素胁迫下最佳内参基因组合；GAPDH,elF-4a、用，刎、SAND、UBQ和胆7

6、Ⅱ为茉莉酸甲酯处理下最适内参基因组合；GAPDH,ACTIN、elF-4a、TIP41和EF-la为水杨酸处理下的最适内参基因组合，可以对目的基因进行精确的标准化。3．处理组合：ACTIN、UBQ、胆』口争TUB被选作“非生物胁迫’’组的最佳内参基因组合；elF-4a、GAPDH,ACTIN乖TUB被选为“激素处理”组的最佳内参基因组合；ACTIN和TUB，可以选择作为“总’’组的最适内参基因组合。4．综合分析，在胡萝卜叶片中，ACTIN和TUB为所有样本组合中最稳定的基因，但单胁迫下其稳定性排名有较大变化。GAPDH在大多数单胁迫下显示出较大的稳定性．关键词：胡萝卜；再生体系；内参基因；非

7、生物胁迫；激素处理；实时定量PCRⅡ万方数据EFFIC磁NTREGENERATIoNSYSTEMESTABUS丑眦NTANDSUITABLEREFERENCEGENESSELECTIoNoFCARRoTABSTRACTCarrot(DaucuscarrotL．)，abiennialherboftheApiaeeaefamily，isamongthemostimportantvegetablecropsinth