鸡黑素皮质素4受体camppka信号通路特点及其细胞筛选模型的建立

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1、－．＇＾－＇吉攻＾方心－古於巧巧苗亡＇＂．公令＞寺賓气亨—＇．＾心‘人．＼麥度／、，Ｓ．冰＇Ｖ、斬．＂＊、／．，、ｉ：朽均＇炒．Ｖ考議苗媛叫义拿終髮－‘－ＹＡＮＧ屬ＵＵＮＩＶＥ民ｓｎｒ句、５＾Ｉ．味ｊ，人：＾．－－＇？－：：？八＾谭每＾硕壬学侄冷文＇＊？．？－■？■？－ｔ？；‘＊＞公—心＿＇？＾（学术型）＇鸡黑素皮质素４受体ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号通路特点及其细胞筛选－Ｖ．型的建立，模、苗周家华謂女，一＇指导教师姓名：王志强教授，扬州欠学，江苏扬州，２２５００

2、９艺申请学位级别：硕壬学束斗专业名称：基础兽医学论文提交日期：２０１５年５月论文答辩日期：２０１５年６月５曰一学位授予单位：扬州大学学位授予日期：２０１５年６月３０曰下夸＾答辩委员键版高玉时研究员凉‘读论文评阅人：逢統教授心－、？＾－．■＂－－Ｈｊ：金織知與是含＾＇础分亀＇伊翁違满變．郝ｇ带Ｗ無！祭条？－－入只兵Ｔ．：去游心．户％存句召＿周家华；鸡黑素皮质素４受体ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号通路特点及其细胞筛选模型的建立１＿鸡黑素皮质素４受体ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号通路特点及其细胞筛选模型的建立研究生：周家华导师：

3、王志强教授专业：基础兽医学（扬州大学兽医学院，扬州２２５００９）中文摘要（－４ｒｅｃｅＲ黑素皮质素４受体ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎｐｔｏｒ，ＭＣ４）是黒素皮质素受体（ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｍ一ｒｅｃｅ－ｐｔＯＴＳＭＣＲｓ）家族成员之，属于Ｇ蛋白偶联受体（Ｇｒｏｔｅｉｎｃｏｕｌｅｄｒｅｃｅｔｏｒｓ，ＧＰＣＲｓ），ｐｐｐ超家族成员。ＭＣ４民广泛存在于动物的中枢神经系统中，主要生理学功能是控制食欲和体重，从而维持体重稳态。ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号通路是ＭＣ４民的经典信号通路，当激动剂或括抗剂与ＭＣ４Ｒ结合后，改变细胞内ｃＡＭＰ的水平，进而改变蛋

4、白激酶Ａ（ＰＫＡ）的状态，引发相应的生理学效应。目前，而且Ｗ人ＭＣ４Ｒ，关于人、猪等动物ＭＣ４Ｒ及其突变体信号通路的研究已见报道为祀点的高通量药物筛选模型已成功建立。但对鸡ＭＣ４民ＭＣ４艮）及相关突变位点的研（ｃ巧只集中于基因多态性与经济性状之间关系的研究。而关于ｃＭＣ４民及其突变体信号遥路的研究却很少。本研究在ｃＭＣ４民野生型（ＷＴ）及４个突变体真核表达质粒成功构建的基础上，利用－三种ＭＣ４民激动剂（ａ－Ｍ細－Ｍ細、Ｐ、ＮＤＰＭＳＨ）和枯抗剂（ＳＨＵ９１１９）研究和探讨了配体对ｃＭＣ化ＷＴ及突变体ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号通路的影响。并且基于ｃＭ

5、Ｃ化信号通路，应用报告基因法建立了ＷｃＭＣ４民为帮点的细胞筛选模型，为筛选出ｃＭＣ４艮激动剂和反向激动剂奠定了基础。主要研究结果如下：１、为了研究ＣＭＣ４ＲＷＴ及４个突变体（Ｑ１８Ｈ、说１Ｒ、Ｓ７６Ｌ和Ｌ２９９Ｐ）的基础活性，本研究将ＣＭＣ４ＲＷＴ及４个突变体的真核表达质粒与蛮火虫巧光素酶报告基因质粒ＧＬ４－．２９ｌｕｃ２Ｐ／ＣＲＥ／Ｈｒｏ、ＲＬＴＫ共ＨＥＫ２９３Ｔ细ｐ海肾巧光素酶内參质粒ｐ转染胞，应用双［ｙｇ］报告基因法检测受体在无配体作用时癸光素酶的表达水平，间接反映ｃＭＣ化ＷＴ及４个突变体的基础活性。结果显示Ｑ１組的基础活性极显著高于Ｗ

6、Ｔ（ＰＯ．Ｏｌ）Ｌ２９９Ｐ的基础活性极，显著低于ＷＴ（Ｐ＜０．０１），化化和Ｓ７化的基础活性与ＷＴ的相比差异不显著（Ｐ＞０．０５）。扬州大学硕止？ｎ学位论文２、为了研究不同激动剂对ＣＭＣ４ＲＷＴ及４个突变体ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号通路的影响，本研巧将ＣＭＣ４ＲＷＴ及４个突变体的真核表达质粒与报告基因质粒、内参质粒共转染ＨＥＫ２９３Ｔ－－Ｍ細－细胞，检测受体在激动剂（ａＭＳＨ、Ｐ、ＮＤＰＭＳＨ）的作用下巧光素酶的表达量，－＝ｃ－－反映细胞内ＡＭＰ水平。结果发现Ｈ种激动剂的内在活性为：ＮＤＰＭＳＨ＞ａＭＳＨＭＳＨＰ；４个突变体中ＣＭＣ４Ｒ

7、Ｌ２９９Ｐ的ｃＡＭＰ水平极显著低于ｃＭＣ４ＲＷＴ（ＰＯ．Ｏｌ），说明该突变对ｃＭＣ４民结构和功能的影响较大，使ｃＭＣ４民几乎失去了与激动剂的结合能力。３、为了研究ＭＣ４Ｒ枯抗剂和激动剂共同作用对ｃＭＣＭＲＷＴｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号通路的影响，本研究将ＣＭＣ４ＲＷＴ真核表达质粒与报告基因质粒、内参质粒共转染ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，－－ＳＨＵ９ＭＳＨ、ＮＤＰ－检测受体在枯抗剂１１９和激动剂（ａＭＳＨ、ＰＭＳＨ）的共同作用下巧光－－素酶的表达量，反映细胞内ＣＡＭＰ水平。结果表明，无论何种激动剂（ａ