鸡源沙门氏菌诱导家蝇幼虫所产生部分差异基因的表达与产物活性研究

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1、分类号：S859.7单位代码：10193密级：公开学号：2012610硕士学位论文鸡源沙门氏菌诱导家蝇幼虫所产生部分差异基因的表达与产物活性研究Cloning，ExpressionandActivityofdifferentialgeneofMuscadomesticalarvaeInducedbySalmonella作者姓名：孙小宁学位类别：农学硕士专业名称：基础兽医研究方向：兽医药理与毒理学指导教师：马红霞所在学院：动物科学学院2015年5月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研

2、究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大

3、学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要抗生素自问世以来，挽

4、救了无数生命，为人类和动物的健康做出了巨大贡献，然而不规范使用抗生素，致使临床致病菌逐渐产生了耐药性。因此，寻找新型、绿色、安全的抗菌剂代替抗生素，已成为当前国内外抗菌药物研究的一项重要内容。抗菌肽(antibacterialpeptides)是生物体内产生的一类具有抗菌活性的小分子多肽，是生物先天免疫的重要组成成分，抗菌肽不但具有广谱的抗菌活性，还具有高效的抗真菌、病毒和原虫的活性，倍受国内外学者青睐。而家蝇从幼虫到成虫均表现出很强的环境适应能力，其体内外常携带多种病原菌，却极少出现集体发病的现象，这源于其体内产

5、生的多种抗菌肽及抗菌蛋白。因此，家蝇抗菌肽有可能成为新一代的抗生素替代品。本研究以鸡沙门氏菌诱导家蝇幼虫构建的抑制性消减文库（SSH）中筛选得到的部分差异基因片段为基础，进行全长差异基因的克隆、表达，并对其表达产物的生物活性进行初步研究。以沙门氏菌诱导家蝇幼虫cDNA为模板，采用cDNA末端快速扩增技术（RACE），对乙醇脱氢酶基因MdADH进行PCR扩增和序列分析。将乙醇脱氢酶基因MdADH、家蝇双翅肽基因MdDpt-I、家蝇溶菌酶基因Mdd与表达载体连接，构建重组表达质粒MdADH-pET-28a、MdDptI

6、-pET-28a和Mdd-pET-32a，转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，进行IPTG诱导和SDS-PAGE电泳分析。利用镍离子亲和层析柱对融合蛋白进行纯化，并对融合蛋白进行生物学活性分析，主要实验结果如下：1、家蝇乙醇脱氢酶基因MdADH的ORF序列为807bp，编码268个氨基酸。其氨基酸序列具有短链脱氢酶的保守结构域，属于短链脱氢酶超家族成员（SDRsuperfamily），具有脱氢酶的活性部位（activesite）和辅酶结合位点（NAD(P)bindingsite）。分子量为29.6ku，理论等电点为

7、7.65，无明显跨膜区，不属于膜蛋白或分泌蛋白，无信号肽区域。2、成功构建了重组表达质粒MdADH-pET-28a、MdDptI-pET-28a以及Mdd-pET-32a，转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。借助亲和层析柱纯化方法，成功获得了高纯度的的融合蛋白。3、生物活性鉴定。通过瓦勒霍赫法检测出MdADH融合蛋白具有乙醇脱氢酶活性，MdADH融合蛋白的小鼠的体内试验结果表明，MdADH具有缩短醉酒时间的作用。MdDptI-pET-28a质粒表达的融合蛋

8、白对临床分离的大肠杆菌与沙门氏菌具有明显的抑制作用，对猪源链球菌无明显的抑菌作用。Mdd-pET-32a质粒表达的融合蛋白对临床分离的大肠杆菌具有明显的抑制作用，对猪源链球菌有一定的抑制作用，对沙门氏菌无抑制作用。I关键词：家蝇；乙醇脱氢酶；家蝇双翅肽；家蝇防御素；原核表达；活性研究IIAbstractSincetheadventofantibiotics,