蛇足石杉离体叶状体生产石杉碱甲的工艺条件研究

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1、分类号：__________________密级^________________tr学校代码：10414学号：402012160041U窗师忽犬学硕士研究生学位论文蛇足石杉离体叶状体生产石兮碱甲的工艺条件研究ResearchofHuperzineAProductionProcessesfromHupcrziaserratainvitro吉枝单院所：生命科学学院导师姓名：涂艺声学位类别：工程颂士专业学位专业领域：生物工程二〇一^五年六月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以

2、标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日缩略词缩略符号英文名称中文名称IAA3-IndoleButyticAcid吲哚乙酸NAAα-NaphthylaceticAcid萘乙酸ZTZiatin玉米素PODPeroxidase过氧化物酶APSAmmoniumpersulfate过硫酸胺N,N,N',N'-TetramethylTEMED四甲基乙二胺ethyl

3、enediamineTris三羟甲基氨基甲烷MS基本培养基MSMurashigeandSkoogB5GamborgB5基本培养基N6朱至清N6基本培养基WhiteWhiteWhite基本培养基摘要本研究以庐山野生蛇足石杉茎尖离体诱导出具有代谢石杉碱甲(抗老年痴呆症药物)能力的叶状体为研究对象，通过优化培养条件及石杉碱甲提取工艺，筛选出高产石杉碱甲叶状体株系。基础培养基筛选设计（B5、6，7-V，MS、N6、White）；用正交实验对植物生长物质浓度进行筛选；蔗糖用量（g/L）设计为10、15、20、25、30。光照条件设计为不同光质（红光、白光

4、、蓝光），光照时间（12h/d，14h/d），光照强度(0lx、1000lx、1500lx、2000lx)。石杉碱甲提取工艺设计为：酒石酸浸泡培养物干粉时间（12h、18h、24h、30h、36h）；酒石酸浸泡培养物干粉体积（10mL、20mL）。采用薄层层析及高效液相色谱法对石杉碱甲进行定性定量检测。用Logistic模型拟合叶状体的生长曲线模型；通过POD酶考察其培养过程中相关遗传物质的稳定性。从而为蛇足石杉离体培养产石杉碱甲技术提供一定的理论基础，本实验研究结果如下：1.在植物离体培养技术中，培养基配方是细胞增殖的主要因素，本实验结果表明

5、不加激素的1/4MS+20g/L蔗糖的固体培养基是叶状体的最佳增殖培养基。2.光调控是植物离体培养生长及合成次级代谢物至关重要的因素，本试验结果表明：以白光为主要光源，光照时间为12h/d，光照强度1500lx左右的条件是叶状体增殖产石杉碱甲的最佳光照条件，相对增殖率达到3174.5%，石杉碱甲累积量达到72.45ug/L。3.本试验优化的石杉碱甲提取工艺：2%酒石酸浸泡24h，超声30min，重复三次，氯仿萃取5次，自然风干后甲醇提纯。筛选出氯仿/丙酮/异丙醇/氨水（4:4:2:0.1，v/v/v/v）薄层层析效果最好；分离效果最佳的高效液相

6、色谱条件：流动相为甲醇-醋酸铵（0.08mol/L;pH=6）=3:7，流速:0.8mL/min，检测波长:308nm，柱温:25℃，进样量：20μL。4.在培养条件优化的基础上，探索了叶状体增殖及合成石杉碱甲的动力学，蛇足石杉离体叶状体增殖的生长曲线呈“S”形，继代周期以50d左右为最适；60d后生长进入稳定阶段，累积石杉碱甲明显加快，直至85d达到最大值7.453ug/g，即叶状体先快速增殖，后累积石杉碱甲。叶状体累积石杉碱甲与叶状体增殖成非生长偶联型，叶状体增长规律符合Logistic生长模型，最大的比生长速率（umax）为0.071/d

7、。5.分析不同生长阶段的叶状体POD同工酶色谱图，得出叶状体在生长过程I中POD酶没有发生变化，随着培养时间增长，条带染色越来越深，在70d达到最深，说明叶状体的POD酶代谢活动在70d相对最高关键词：蛇足石杉；离体叶状体；石杉碱甲；Logistic生长模型；POD同工酶IIAbstractThepurposeofthisstudywastoinvestigatethefactorsanddynamicvaritationrulefortheaccumulationofHuperzineA(HupA)fromHuperziaserrata(H.

8、serrata)thalluswhichcouldproduceHupA,ananti-Alzheimer’sdiseasedrugcandidate