碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌耐药机制研究

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1、碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌耐药机制研究STUDYONCARBAPENEMRESISTANCEMECHANISMSOFACINETOBACTERBAUMANNII研究生姓名：应春妹学号：T2011007学科专业：内科学指导教师：杨程德教授研究方向：细菌耐药机制研究申请学位：博士培养单位：上海交通大学医学院附属仁济医院国家自然科学基金面上项目（81371874）；资助项目：上海市科委课题（11ZR1421200）论文提交日期：2015年4月答辩日期：2015年4月III上海交通大学医学院2011级博士研究生学位论文碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌耐药机制研究摘要目的本研究通过了解我院鲍曼不动杆菌

2、感染情况、耐药特征与流行趋势，研究重症监护病房临床菌株与环境菌株耐药特征，检测耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌水解酶及外排泵基因，检测主动外排系统结构基因与调控基因在亚胺培南耐药组(imipenem-resistantAcinetobacterbaumanniiIRAB)与敏感组(imipenem-sensitiveAcinetobacterbaumanniiISAB)中分布差异，对主要外排基因进行表达量分析，并研究外膜蛋白Omp34介导鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药，深入探讨鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药机制。方法1、本实验收集2012年7月到10月我院临床分离鲍曼不动杆菌共78株，并采用

3、ERIC-PCR及PFGE技术对该78株临床分离株进行同源性分析，了解本院鲍曼不动杆菌是否存在克隆株的播散流行。2、同期采用琼脂稀释法检测神经外科重症监护病房（IntensiveCareUnit，ICU）27株临床菌株和28株环境菌株对常用抗菌药物的最低抑菌浓度；用肠杆菌科基因间重复序列PCR（EnterbacteriatRepetitiveIntergenicConsensus,ERIC-PCR）、多位点序列分型（MultiLocusSequenceTyping,MLST）及脉冲场凝胶电泳（PulsedFieldGelelectrophoresis，PFGE）技术对共分离的55株鲍曼

4、不动杆菌进行基因分型，分析其可能的传播途径。3、采用聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR）检测78株临床菌株β-内酰胺酶基因（OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58、IMP-1、VIM-1、VIM-2、Amp-C）及RND家族3个主要外排系统AdeABC、AdeIJK及AdeFGH结构基因（adeB、adeJ、adeF、adeG、adeH）与调控基因（adeR、III上海交通大学医学院2011级博士研究生学位论文adeS、adeL）的携带情况，比较其在IRAB及ISAB中分布差异，进一步使用Realtime-PCR对其主要外排基因进行表达

5、量分析，初步探讨鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药机制。4、研究通过采用双重同源重组技术在鲍曼不动杆菌ATCC19606中构建Omp34基因的缺失突变株（ATCC19606-△Omp34），采用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PolyacrylamideGelElectrophoresis，SDS-PAGE）蛋白电泳分析外膜蛋白的表达，PCR法和基因测序进一步验证Omp34基因敲除。比较野生株和敲除株对常用抗菌药物尤其是碳青霉烯类的抑菌圈大小，以探讨外膜蛋白Omp34在介导鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药中的作用。结果1、临床分离78株鲍曼不动杆菌只对米诺环素耐药率稍低，为30.9

6、%；其次为亚胺培南，耐药率为53.1%；对其它抗菌药物耐药率均超过60%；对头孢西丁、复方新诺明耐药率最高，分别为97.5%、93.8%。78株鲍曼不动杆菌ERIC-PCR结果显示可分为A、B、C、D、E、F6型，A型62株，为主要克隆株，其中A型又分为A1型46株，A2型16株，B型7株，C型6株，D、E、F型各1株。PFGE主要分为7型，A型56株（包括A1、A2、A3三个亚型），B型7株，C型4株，D型5株，E型3株，F型2株、G型1株。2、临床分离27株鲍曼不动杆菌除对替加环素、粘菌素全部敏感，对其他14种抗菌药物普遍耐药，米诺环素耐药率稍低，为25.9%。其次为头孢哌酮/舒巴

7、坦与亚胺培南，耐药率分别为51.9%、59.3%，对其他抗菌药物的耐药率均超过70%，对复方新诺明全部耐药。环境分离28株鲍曼不动杆菌相比临床分离菌株更为敏感，替加环素和粘菌素全部敏感，对美罗培南和头孢哌酮/舒巴坦的耐药率均为3.6%，对与亚胺培南耐药率为7.1%，对米诺环素、哌拉西林/他唑巴坦耐药率均为10.7%，对头孢西丁耐药率最高，为92.9%。27株临床分离鲍曼不动杆菌ERIC-PCR基因分型主要为A、B、C三型，其中A型20株，B型6