海洋丝状真菌石油高效降解菌株的筛选及其酯酶基因克隆

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1、分类号：S432.1Q939.97单位代码：10183研究生学号：201286J002密级：公开吉林大学硕士学位论文（专业学位）海洋丝状真菌石油高效降解菌株的筛选及其酯酶基因克隆Isolation,identificationandlipasegenecloningofhighlyefficientpetroleumdegradingstrainsofmarinefilamentousfungi作者姓名：王军类别：农学硕士领域（方向）：植物保护指导教师：张世宏教授培养单位：吉林大学2015年12月海洋丝状真菌石油高效降解菌株的筛选及其酯酶基因

2、克隆Isolation,identificationandlipasegenecloningofhighlyefficientpetroleumdegradingstrainsofmarinefilamentousfungi作者姓名：王军领域（方向）：植物保护指导教师：张世宏教授类别：农学硕士答辩日期：2015年12月5日未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）

3、。。否则，应承担侵权的法律责任吉林大学博或硕±学位论文原创性声明）本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本。文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中明确方式标明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名；至罕曰期：年１／月１中文摘要海洋丝状真菌石油高效降解菌株的筛选及其酯酶基因克隆海洋是人类赖以生存的重要资源，海洋石油开采和运输过程常因石油泄漏造成海洋

4、严重污染。据初步统计，我国沿海近四十年来（1973-2011年）发生船舶溢油事故约3000起，平均4-5天发生一起污染事故。其中，一次性泄漏50吨以上的溢油事故95起，年均2.5起，平均每起污染事故溢油量537吨，溢油总量达38500吨。以蓬莱19-3油田溢油事故为例，大量石油类污染物进入水体和沉积物，造成蓬莱19-3油田周边及其西北部总计870平方公里海域海水受到严重污染，其海水中石油类含量超过背景值53倍之多。该次溢油事故导致污染海域的浮游生物种类和多样性降低，海洋生物幼虫幼体及鱼卵仔稚鱼受到损害，底栖生物体内石油烃含量明显升高，海洋生物

5、栖息环境遭到破坏，《2014年中国海洋环境状况公报》显示，直到2014年，溢油造成的影响仍然存在。因此，开展海洋石油污染科学快速治理研究成为国内外学者关注的焦点。生物修复是环保、无再次污染、安全可靠的海洋石油污染处理措施，筛选获得高效的海洋石油污染降解菌株是重要环节。由于海洋水资源属于高盐环境，海洋石油降解菌必须具备抗盐特性、易于漂浮水面并与石油结合特性，以及以石油为碳源并利用其生存的能力。实践证明，丝状真菌可能具有上述三个特性，因此筛选海洋中的丝状真菌是泄漏石油处理的前提。本研究从石油污染海洋水域中筛选获得4株石油降解丝状真菌，以其中一株生

6、长速度快的真菌为材料，进行了酯酶的基因克隆和原核表达，获得了高活性的重组酯酶。主要研究结果如下：1、对渤海湾石油污染区的海洋真菌进行了分离。利用石油作为唯一碳源的培养基，筛选了4株可利用石油生存的真菌。通过生物学观察、IST序列扩增和测序鉴定，确定了该4种真菌为赤散囊菌（EurotiumrubrumSH58）、大刀镰刀菌（FusariumculmorumS21）、胶孢炭疽菌（ColletotrichumgloeosporioidesSH4）和I微小根毛霉（RhizomucorpusillusCC2）。其中，EurotiumrubrumSH58

7、的生长速度最快，生物学特性稳定。因此，选择该菌株进行了进一步深入研究。2、在对EurotiumrubrumSH58生物学特性研究基础上，本研究对其酯酶进行了研究。以E.rubrumSH58的mRNA为材料，通过反转录PCR合成cDNA，我们克隆了一个酯酶基因Erlipase；并对其进行了原核表达和融合蛋白的纯化。通过对酯类降解的活性测定，证明该基因的原核表达产物具有较高的酯酶活性。以上结果表明，E.rubrumSH58具有石油降解特性，并且这种特性这与其Erlipase基因的表达相关。研究不仅提供了可用于海洋石油污染治理的生物材料，同时也为环

8、境污染处理和相关微生物的遗传改良奠定了基础。关键词：海洋石油降解真菌；筛选和鉴定；酯酶基因克隆；原核表达IIAbstractIsolation,identifica