莠去津高效降解菌降解途径的研究及其降解基因的克隆

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1、莠去津高效降解菌降解途径的研究及降解基因的克隆中文摘要本文首先以莠去津高效降解菌HB-5为主要研究对象，研究了HB-5降解莠去津的能力及降解途径；另外主要从本实验室已有菌株中又筛选到了一株能够矿化莠去津的降解菌HB-6,研究了HB-6降解莠去津的能力及降解途径，并对HB-6中含有的莠去津降解基因进行了克隆。主要内容如下：1.介绍了莠去津的理化性质、国内外应用概况，以及由于其广泛应用所带来的危害；对莠去津及其降解产物在环境介质中的各种检测方法进行了阐述；在对前人工作总结分析的基础上，对莠去津的降解途径、降解基因及酶系进行了全面系统的综述，进而提出了作

2、者要研究的问题。2．对实验室已经筛选出的莠去津高效降解菌HB-5的降解途径及降解-1能力进行了研究。我们已经知道HB-5能够在24h内将100mg·L的莠去津降解完全，并且通过基因克隆发现，HB-5含有基因TrzN、AtzB、AtzC。我们将HB-5加入到以莠去津为唯一氮源的无机盐培养基中，30℃振荡培养，分别在0h、12h、24h、48h、72h、96h、120h取样，通过液相色谱及HPLC-MS对HB-5降解莠去津的降解产物进行分析，得到了HB-5对莠去津的降解能力及降解途径。-1研究结果表明，在24h内HB-5能够将莠去津（100mg·L）降

3、解完全，同时生成了羟基莠去津和氰尿酸。羟基莠去津在12h的时候生成量达到最大值约为20mg/L然后随着时间的延长逐渐消失，于此同时氰尿酸的生成量-1-1约为96mg·L，然后氰尿酸的量逐渐增加至100mg·L左右，不再变化。用HPLC-MS测定HB-5降解莠去津后的降解产物，我们取24h和96h样品进行液质测定，在不同时间的培养液中我们检测到了两种降解产物，它们的离子大小分别为198(M/Z)和129(M/Z)。我们通过测定莠去津降解产物标准样品和莠去津的降解途径可以得知，这两种物质分别为羟基莠去津、氰尿酸。通过液相色谱和液相色谱质谱的联用我们发现

4、，HB-5能够将莠去津最终降解至氰尿酸，而不能进行下一步的降解。3.对实验室已有的菌株HB-1、HB-3、HB-6、HB-7、HW-23、WB-1进行筛选，以氰尿酸为唯一氮源，测定它们对氰尿酸的降解能力，发现HB-6在24h内对氰尿酸的降解率最高，所以选择HB-6做下一步的实验。1山东农业大学硕士学位论文另外，通过对这株细菌对莠去津的生理耐受能力及其降解能力的测定，发-1现HB-6可在莠去津含量为1000mg·L平板培养基生长，而且在菌落的周围形成一无色透明晕圈。4.我们将HB-6加入到以莠去津为唯一氮源的无机盐培养基中，30℃振荡培养，分别在0h

5、、24h、48h、72h、96h、120h、144h取样，通过液相色谱及HPLC-MS对HB-6降解莠去津的降解产物进行分析，得到了HB-6对莠去津的降解能力及降解途径。-1液相测定的结果为，在24h内HB-6能够将莠去津（100mg·L）降解完全，同时生成了羟基莠去津和氰尿酸。羟基莠去津在12h的时候生成量达-1到最大值约为10mg·L然后随着时间的延长逐渐消失，于此同时氰尿酸也-1达到它的最大值约60mg·L，然后随着时间的推移羟基莠去津及氰尿酸逐渐被完全降解。我们用HPLC-MS测定HB-6降解莠去津后的降解产物，在不同时间的培养液中我们检测

6、到了三种降解产物，它们的离子大小分别为198(M/Z)，129(M/Z)和60(M/Z)。我们通过标准样品和莠去津的降解途径可以得知，这三种物质分别为羟基莠去津、氰尿酸和尿素。而且在144h培养液中无其它降解产物，只有尿素，这就充分说明HB-6能够矿化莠去津。5.高效降解菌对莠去津的降解特性试验表明：培养温度和pH条件对降解菌的生长及其对莠去津的降解有很大的影响，适宜降解菌生长及其对莠去津降解的温度在20℃～40℃之间，pH在6.0～9.0之间；高浓度的莠去津对降解菌的生长及降解能力有抑制作用。6.通过菌种的形态、生理生化实验及16SrDNA对降解

7、菌HB-6进行了鉴定，并且与NCBI已有菌种进行了对比，结果表明HB-6为枯草芽孢杆菌。7.对莠去津高效降解菌HB-6中的莠去津降解基因进行了克隆。根据文献中提供的引物序列为参考序列设计引物，以高效降解菌HB-6的总DNA为模板进行PCR扩增，得到HB-6中的莠去津降解基因分别为atzB、atzC和trzN，并对这些基因进行了测序和序列比对。关键词：莠去津降解途径降解产物基因2莠去津高效降解菌降解途径的研究及降解基因的克隆StudyontheAtrazineDegradativePathwayandAtrazine-degradingGenesin

8、AtrazineDegradingBacterialStrainsWangQiDirectedbyDr.ZhuLushen