圈养野生动物伪狂犬病病毒分离、鉴定与基因分析

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1、分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文圈养野生动物伪狂犬病病毒分离、鉴定与基因分析Isolation,IdentificationandSequenceAnalysisofPseudorabiesvirusfromCaptiveWildFelidsinChina李元果指导教师胡永浩教授（甘肃农业大学动物医学院兰州730070）学科专业名称预防兽医学研究方向动物传染病学及病原分子生物学论文答辩日期2015年5月30日学位授予日期2015年6月答辩委员会主席李克生研究员评阅人冉多良研究员马忠仁教授2015年6月甘肃农业大学2015届硕士

2、学位论文摘要摘要伪狂犬病是由伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus，PrV）感染引起的动物发热、奇痒、脑脊髓炎为典型特征一种传染病。伪狂犬病毒的宿主谱十分广泛，包括猪、牛、犬、猫、鼠、貂、狐和兔等动物。近年来在我国伪狂犬病发病率呈现上升趋势。我们从临床表现为重症呼吸道症状的美洲狮、美洲虎、朝鲜豹、豹猫等多种圈养野生动物组织样品中检测到伪狂犬病毒，并针对性地开展了病毒分离、鉴定、动物回归实验与初步调查研究。2012年2月~2012年3月，北京某动物园2只美洲狮、2只美洲虎、3只豹猫和1只朝鲜豹突然发病，临床表现为精神萎顿、进食量逐渐减少或不食、渴

3、欲增强，后发展为呼吸困难，经常规治疗无效死亡。采集肺、鼻甲骨、肠及内容物、气管、扁桃体、肾、肝、膀胱、脾、睾丸等组织样品共40份。使用伪犬病毒特异性引物gBS/gBA、gDU/gDL进行核酸扩增和序列比对分析证明，上述动物的肺、脾、肝、肾组织样品均呈伪狂犬病毒核酸阳性。依据国标GB/T18641-2002的检测方法，将组织样品匀浆液接种于敏感动物兔，接种后的家兔在接种后12h表现出不安、畏人等伪狂犬病的典型临床特征，至30h后抽搐死亡，符合伪狂犬病毒的敏感动物评价指标。应用Vero细胞进行病毒分离，分离株命名为BJ/Tiger/2012。进一步细胞感染

4、谱实验表明，该病毒分离株在F81上出现CPE的时间最短，引起细胞病变状态为圆缩，集聚等；在MDCK细胞系上引起CPE，使细胞大量融合，出现拉网等；在Vero细胞系最初表现为拉网细胞融合、拉网等状态，但是随着代次的增加病毒逐渐适应细胞，Vero细胞病变由原来的大面积拉网状态转为细胞圆缩、多细胞融合等状态，并且出现病变时间缩短，由原来的72h缩短致48h。生物学与理化特性鉴定发现，该毒株不凝集鸡、猫、豚鼠、昆明鼠、Balb/C小鼠、东北虎的红细胞，经过紫外照射5min或56℃20min灭活病毒。提取BJ/Tiger/2012分离株的第4代细胞培养物总DNA

5、，分别进行gG、gE基因全长和gD保守区的扩增。扩增片段经拼接后分别扩增到与预期片段大小相近的片段。序列测定结果表明，去掉非编码序列后gG全长为1500bp，gE全长1740bp，gD保守区序列为669bp。gG基因与Genbank中的收录的伪狂犬病毒核酸序列同源性为98.9%~99.9%，与我国2013年提交序列登录号为KC981239.1（北京）、KF711985.1（湖南）的核酸序列同源性为99.9%；gE基因与2013年我国提交至GenBank的16株病毒核酸序列同源性为97.8%~100%；gD保守区基因与2011年~2013年美国、韩国、中

6、国（3个省）提交至Genbank的中10株病毒核酸序列同源性为96.6%~100%。进化分析表明，该病毒与KF017275.1、KC415029.1、KF010501.1、KF130886.1、KF017333.1在同一进化分枝，为伪狂病毒强毒株。I甘肃农业大学2015届硕士学位论文摘要为明确该病毒对猫科和犬科动物的致病性，分别进行了BJ/Tiger/2012家猫和家犬的人工感染实验。通过滴鼻的方式接种的家猫，在接种后42h表现出神经紧张、忧郁，随后出现流涎，头颈前挺，背最长肌僵直等临床症状。在出现症状后8h突然倒地强直抽搐死亡。核酸扩增检测表明接种家

7、猫肺、脾、脑、肠、肾的组织均为伪狂犬病毒核酸阳性。病理学检测发现肺泡腔巨噬细胞轻微增多，肾小管上皮细胞坏死、碎裂消失，骨骼肌肌纤维断裂。免疫组化分析发现肺泡上皮细胞，肾小管上皮细胞，脑桥组织细胞，肠系膜淋巴结边缘区淋巴细胞和部分肠粘膜上皮细胞呈伪狂犬病毒抗原阳性。在家犬感染实验中，以滴鼻方式接种的家犬在接种后42h出现表现出精神沉郁、呼吸急促等临床症状。第54h开始出现流涎，头颈前挺，呕吐物中有暗红色泡沫状，70h后死亡。剖检见肺脏呈弥漫性出血和水肿，脾脏增厚、质地较硬，脑积液增多。应用PCR方法检测发现滴鼻接种的家犬肺、脾、脑、肠、肾等组织均为伪狂犬

8、病毒核酸阳性，但胰、骨骼肌组织为阴性。皮下接种组家犬在接种36h后表现出焦躁，羞明、畏光和流泪