与茶酚类涩味物质合成相关的udp-糖基转移酶基因的筛选和功能验证

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1、：：１０３６４位代码分类号＾单密级：：１２７２０２７７学号复教濛进丈ｆ学位论文与茶齡类涩昧物原合成相关的ＵＤＰ４膺基转摇酶墓風酪輸録日玻能验证ＳｃｒｅｅｎｈｉａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＩｄｅｎｔｉ巧ｃａｔｉｏｎｏｆｇ－ｓＵＤＰｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎＪＴｅｒａｓｅｓＩｎｖｏｌｖｅｄｉｎ技ｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｉｌｓｔｒｉｎｇｅ打ｔＰｈｅｎｏｉｉｃＧｏｍｐｏｕ打ｄｓ研究生：崔利兰指导教师：夏涛教授合作指导教师：高丽萍教授申请学位口类级别：■农学硕±专业名称：茶学＾

2、研究方向：茶叶生物化学及天然产物开发所在学院：茶与食品科技学院多寒答辩委员会主席：二零一五年六月独创性声明本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方。据我所知夕ｈ，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表巧谢意。Ｉ兰学位论文作者签名：转平签字日期Ｓ：年＾月／日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解安

3、徽农业大学有关保留、使用学位论文，的规定有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子。本人授权将文件，允许论文被查阅和借阅业大学可学位论安徽农Ｗ文的全部或部分容编入有数据进行检，录到《学内关库索收中国位论文全文数据库》，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编（学位论文，向社会公提供信息服务。密后适众保密的学位论文在解本权书）。用授幸１学位论；：文作者签名指导教师签名＾１？；１签字４＾日期：年日签字日期：日月年月摘要儿茶素（黄烷-3-醇）和黄酮醇糖苷，作为茶叶中主要的保健和药理成分，是茶叶中主要存在的茶多酚，也是红茶和绿茶

4、茶汤中典型的苦涩味化合物。前期研究工作表明，酯型儿茶素的合成涉及一种UDP-葡萄糖：没食子酰-1-O-β-D-葡萄糖基转移酶(UGGT),其中没食子酸（GA）在UGGT作用下，接受糖供体UDP-葡萄糖的糖基团而转化成1-O-β-D-没食子酰葡萄糖（βG）。茶叶中黄酮醇-3-O-糖苷的形成依赖黄酮醇-3-O-糖基转移酶（F3GT）的催化。UGGT和F3GT均属于糖基转移酶中GT1家族，直接或间接参与了茶树涩味化合物的生物合成。因此，筛选参与涩味物质合成相关UGT基因并研究及其功能，对茶树育种和茶叶品质调控具有非常重要的意义。本论文通过基于NCBI-blastp分析和在线软件J

5、pred软件预测的基因筛选技术，对茶树转录组数据库中UGTs序列进行了筛选；利用FULL-RACE技术对候选基因进行了全长克隆；利用进化树分析及同源建模对候选的UGT基因进行功能预测；利用原核表达和酶活性检测技术验证了候选基因的功能。主要研究结果如下：1.利用NCBI-blastp软件对本实验室的转录组数据库中的GT序列进行搜索，结果显示CsUGT84A1与已鉴定功能的三条葡萄VvgGTs一致性达到80%以上，因此，选择CsUGT84A1为候选UGGT基因，并做进一步功能验证。此外，通过在线软件Jpred对数据库中的GT序列进行功能预测，结果表明，CsUGT78E1和CsU

6、GT78F1基因编码的氨基酸序列与已知葡萄UDP-葡萄糖：花青素3-O-葡萄糖基转移酶(accessionnumber:P51094.2，PDBid:2c9z,VvGT1)的最相似，一致性分别为55%和53%，因此，选择CsUGT78E1和CsUGT78F1为类黄酮3-O-糖基转移酶相关的候选基因，并做进一步功能验证。2.通过FULL-RACE全长克隆技术，克隆了CsUGT84A1、CsUGT78E1和CsUGT78F1的cDNA全长序列，并经UGT命名委员会统一命名为CsUGT84A22、CsUGT78A14和CsUGT78A15。使用MEGA软件，对三条基因编码的氨基酸

7、序列进行进化树分析和功能预测，结果显示：CsUGT84A22分布在L组，属于为1-O-酰基-葡萄糖酯糖基转移酶分支，而CsUGT78A14和CsUGT78A15分布在类黄酮-3-O-糖基转移酶进化树分支。3.利用PyMoL软件，以VvGT1的2c9z为模板，对CsUGT78A14和CsUGT78A15进行同源建模并进一步预测其蛋白质的功能。同源建模分析表明CsUGT78A14和CsUGT78A15与葡萄VvGT1的2c9z晶体结构具有高度相似性。经ClustalX多序列比对发现，CsUGT78A14和CsUGT78