重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白的过程优化研究

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1、西北大学博士学位论文重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白的过程优化研究姓名：骆艳娥申请学位级别：博士专业：化学工程指导教师：范代娣20050101西北大学学位论文知识产权声明书本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文章一律注明作者单位为西北大学。保密论文待

2、解密后适用本声明。学位论文作者签名：逮圭叁熊指导教师签名：蓝盘盛沙S年厶月ⅪEt矽￡年印月卯日西北大学学位论文独创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：懿建《茹跏r年审月如日西北大学2005届博士学位论文摘要本文对重组大肠杆菌分批．补料培养生产类人胶原蛋白的发酵条件即补氮方式(

3、快循环补氮即间隔时间为0．5min、慢循环补氮即间隔时问为4min)、控氧方式(提高罐压、充入富氧空气、葡萄糖反馈调控)和诱导强度、诱导前后的比生长速率、代谢流分析、动力学模型及流加发酵的最优控制进行了系统的研究，结果表明：1．最佳的发酵条件为：采用快循环补氮方式流加氮源，补料速率为3．34巧．06"100L／rain：当溶氧低于20％(空气饱和度)，适当提高罐压(O．3加．8"105Pa)维持溶氧在20％；最佳诱导条件为420C保温2～3h，然后降温至39℃继续培养5-6h，发酵结束时细胞浓度和类人胶原蛋白的浓度可分别达68．94g／L(Dcw)和13．16g／L。

4、2．诱导前的比生长速率影响细胞生长和类人胶原蛋白的表达，为获得尽可能多的细胞和目标蛋白，诱导前的最适比生长速率为0．15-0．20h．1；诱导后的比生长速率对表达期的细胞生长和类人胶原蛋白的表达产生显著影响，在此期间比生长速率过高或过低均不利于目标蛋白的合成，且最适比生长速率为0．04—0．05h～，发酵结束时细胞和类人胶原蛋白的浓度可分别达69．5g／L(DCW)和13．8g／L。3．①诱导前的比生长速率不仅对第1II阶段的细胞生长产生影响，而且对表达期(第1v阶段)的类人胶原蛋白的合成产生影响。在第ⅡI阶段，随着比生长速率的增大，进入磷酸戊糖(PP)途径的碳流量先

5、增大后减小，当比生长速率为O．15h4时达最大值，其次是O．20h。1的，以合成足够的前体和NADPH满足细胞生长所需；在诱导后，随着比生长速率的增大，进入磷酸戊糖(PP)途径的碳流量逐渐减小，而进入三羧酸循环(TCA)的碳流量随着类人胶原蛋白比产率的增大而稍有减小，以提供足够的前体和能量合成目标蛋白。代谢流分析从细胞水平阐述了诱导前的最适比生长速率为O．15-0．20h～。②诱导后的比生长速率对第Ⅳ阶段的细胞生长和类人胶原蛋白的合成都产生影响。在诱导后，随着比生长速率的增大，PP途径的碳流量增大，以满足细胞生长的前体和能量需求；TCA循环的碳流量随着比生长速率的增大

6、先减少后大幅度增加，为提供目标蛋白合成所需的足够的前体和能量，O．04．49．05h4时TCA循环的碳流量最小，且在诱导后比生长速率过大会造成极大的能量浪费，故诱导后的最佳比生长速率为O．04-0．05h一。③随着发酵的进行，进入PP途径的碳流量显著减少，且从PP途径回流到EMP途径的碳流也显著减少，同时进入三羧酸(TCA)循环的碳流量显著增大，以产生足够重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白的过程优化研究2的能量来维持细胞的活性，在诱导后为类人胶原蛋白的合成提供足够的能量。4．利用MATLAB最小二乘法Isqnonlin)和四五阶Runge．kutta(ode45)

7、对动力学模型的参数进行优化求解，结果表明动力学模型与实验值吻合良好。在分批发酵阶段，动力学模型为0．727s“。—0．674—+s’ds出O．727sx在补料阶段(诱导前)的动力学模型为0．727s’0．674+s仃．上+0．054：0．321在诱导阶段动力学模型为0．727sⅡ。—0．67—4+s’仃。—L+0．054+_L，0．3210．064Jr。一2．160“+0．489—0．00___23。’“5．根据庞特里金最小值原理，以获得最高类人胶原蛋白产量为目标函数，通过利用MATI．AB的多变量有约束最优化(fmincon)求解已建立的动力学模型