单纯疱疹病毒ⅱ型糖蛋白g重组质粒构建、表达及鉴定论文

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1、摘要单纯疱疹病毒II型糖蛋白G重组质粒的构建、表达及鉴定硕士研究生：成桂明指导老师：杨慧兰摘要单纯疱疹病毒II型(HSV，2)是引起生殖器疱疹(genitalherpes，GH)的主要病原体。HSV一2感染需要实验室检查来确诊，但我国目前HSV．2感染的实验室诊断均依赖于价格昂贵的进口试剂。这给我国的生殖器疱疹的临床诊治工作和开展大规模的流行病学调查带来一定的局限性。糖蛋白gG．2是抗HSV一2体液免疫应答的主要靶位，可作为HSV．2感染的型特异性抗原，在血清分型诊断、临床应用及疫苗研制方面的应用前景已得到广泛关注。据此

2、，本研究利用质粒表达载体pGEX-4T-1克隆和表达编码HSV一2gG的免疫优势表位片段，旨在建立一种HSV-2感染早期、快速、敏感和特异的诊断方法，为进一步研制国产的基因工程诊断试剂奠定理论和技术基础。根据HSV．22G编码基因序列，针对该片段的免疫优势表位区设计并合成特异性引物。从生殖器疱疹患者的疱液中提取HSV一2基因组，采用PCR技术扩增获得目的基因片段fFgG，2)并纯化回收该目的片段。纯化后的目的片段及质粒载体pGEX。4T．1分别经EcoRI和XhoI双酶切后连接并转化大肠杆菌TG．1，铺于Amp阳性的LB

3、平板上置温箱孵育。挑取阳性单菌落置于Amp阳性的LB溶液中振荡培养，取一部分培养液提取重组质粒进行PCR鉴定、双酶切鉴定和序列测定，另一部分用IPTG诱导表达。离心收菌后，取少量菌体沉淀进行SDS-PAGE及免疫印迹鉴定。其余的菌体沉淀经超声裂解破菌后再次离心，收集沉淀。加入4％SDS将该沉淀振荡使其充分溶解，离心收集上清并进行SDS—PAGE电泳检测。用GST柱纯化该蛋白，再次SDS．PAGE电泳检测纯化的目的蛋白。以获得的HSV2-gG／GST融合表达蛋白作抗原，ELISA问接法检测已知的抗HSV-2lgG阳性血清、

4、抗HSV一2摘要IgM阳性血清及正常人血清。在退火温度为52℃时扩增出与预期结果相符的目的基因片段1241bp。重组质粒的PCR鉴定及双酶切鉴定可扩增出与目的基因片段大小一致的DNA片段。初步证实目的基因片段FgG一2已正确插入质粒载体pGEX．4T一1中。经过比对分析，结果显示所测得的DNA序列与目的基因序列一致，且阅读框架正确。进一步证实DNA插入序列正确。重组表达蛋白rFgG一2的SDS．PAGE电泳检测显示诱导后重组质粒菌在分子量约66．2kD处出现特异蛋白条带，与预测的大小相符。对该产物进行免疫印迹检测，结果显

5、示在非诱导表达条件下的表达产物未出现与HSV2．gG单克隆抗体McAb反应的条带；而1PTG诱导产生的rFgG．2蛋白与McAb出现明显的反应条带。表明诱导表达的rFgG一2蛋白抗原与HSV2一gG的McAb具有良好的抗原性和特异性。GST柱纯化获得的融合表达蛋白HSV2．gG／GST，经SDS．PAGE电泳检测显示在66．2kD处出现一条清晰的特异蛋白条带。表明已获得纯化的HSV2一gG／GST融合蛋白。间接ELISA检测显示，该融合蛋白抗原能分别与抗HSV一2IgGgH性血清、抗HSV．2IgM阳性血清反应，而不与正

6、常人血清反应。表明HSV2．gG／GST融合蛋白抗原对抗HSV．2阳性血清抗体具有较好的抗原性和特异性。本研究利用分子克隆技术成功构建了高效融合表达的单纯疱疹病毒II型糖蛋G重组质粒(pGEX4T．1／HSV2．gG)；已获得抗原性和特异性较强的纯化HSV2．gG／GST融合蛋白抗原。为进一步研制HSV一2诊断试剂盒奠定了一定的基础。关键词单纯疱疹病毒外膜糖蛋白G基因克隆基因表达纯化鉴定ABSTRACTConstruction，ExpressionandIdentificationoftherecombinedplasm

7、idofGlycoproteinGofHSV．2Name：ChengguimingSupervisor：YanghuilanHexessimplexvirustype2(HSV一2)istheprimarypathogenofgenitalhexes(GH)HSV一2infectionisdefinitelydiagnosedbylaboratorymethod．However，laboratorydiagnosisHSV·2infectioninourcountrypresentlydependsonexpensive

8、importreagent，whichlimitsdiagnosisandtherapyofHSV·-2infectionandlarge-scaleepidemiologicalinvestigationGlycoproteinGisthemajortargetofhumoralimmuneresponsetoHS