肠炎沙门菌c50041crp、spic基因缺失株的构建及其免疫生物学特性研究

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1、李宝利：肠炎沙门菌C50041crp、spiC基因缺失株的构建及其免疫生物学特性研究!肠炎沙门菌C50041crp、spiC基因缺失株的构建及其免疫生物学特性研究研究生：李宝利导师：焦新安教授耿士忠副教授中文摘要沙门菌引起的食源性疾病，具有重要的公共卫生学意义。家禽是沙门菌的主要宿主之一，因此，加强家禽沙门菌病的防控研究，不仅能保证家禽的生产性能，而且能够从源头减少人因摄入沙门菌而导致的疾病。近年来，利用基因工程技术，将病原菌相关基因敲除，构建新型减毒沙门菌作为疫苗的研究备受关注。新型减毒活疫苗具有免疫力坚实、免疫期长等特点，在预防控制沙门菌的感染方面具有明显优势。本研究通

2、过)LRed重组系统和自杀性质粒介导同源重组的方法，分别将肠炎沙门菌C50041株毒力相关基因spiC和代谢相关基因crp敲除，构建相应的单基因和双基因缺失突变菌，并评价了其生物学特性，探索了这些突变株作为减毒活疫苗的可行性。1肠炎沙门菌C50041crp、spiC基因缺失株构建与鉴定以肠炎沙门菌C50041基因组为模板，PCR扩增出crp基因上游925bpDNA序列，以及crp基因下游936bpDNA序列。将上游片段、Cm抗性基因片段及下游片段连接，成功构建重组质粒pMD-Acrp／Cm。以重组质粒为模板，扩增打靶片段，其中间为Cm抗性基因，为两端crp基因同源臂。在LR

3、ed重组系统协助下，将野生型C50041的crp基因敲除，在Cm抗性平板上筛选阳性克隆。电转化编码FLP重组酶的温度敏感型质粒pCP20，转入上述筛选获得的阳性克隆中，以去除Cm抗性基因。PCR和测序鉴定结果表明，crp基因缺失株C50041Acrp构建成功。通过重组自杀质粒pGMBl51-zispiC／Km介导的同源重组，进一步敲除肠炎沙门菌C50041和C50041Acrp突变株的spiC基因，成功构建C50041AspiC和双缺失株C50041AcrpAspiC／Km。对3株缺失菌的生化特性、生长特性以及毒力等的鉴定结果表明，spiC基因的缺失对C50041的生化特性

4、与生长特性无显著影响：但crp基因缺失后，C50041对多种糖类物质的代谢情况发生改变，且生长速度显著下降。细菌C50041AspiC的LD50约为2．87×106CFU，C50041Acrp的LD50约为3．89×106CFU，C50041AcrpAspiC／Km的LD50约为5．36×106CFU，3个缺失株之间差别不显著，但与C50041野生株LD50(约为3．11×103CFU)相比较而言，升高了约1,000倍左右。2肠炎沙门菌C50041缺失株免疫生物学特性研究扬州大学硕士学位论文选取小鼠巨噬细胞系RAW264．7为模型进行细胞侵袭实验，结果显示，与野生株相比，3

5、株突变菌对RAW264．7细胞的黏附力明显降低，但3株突变菌之间差异不显著p>0．05)；3株突变菌对RAW264．7细胞的侵袭力明显降低，C50041AcrpAspiC／Km和C50041Acrp与C50041A．spiC缺失株之间存在极显著差异(p知．01)，C50041AcrpAspiC／Km与C50041Acrp缺失株之间存在显著差异(p如．05)。将3株缺失菌和野生菌以肌肉注射方式接种1日龄雏鸡，在肝脏，各缺失株在第10天均检测不到；在脾脏，以双缺失菌C50041AcrpAspiC／Km最先被清除，C50041Acrp缺失株其次，C50041AspiC缺失株持续时

6、间最久；而野生型C50041在接种后第6天全部死亡。利用间接ELISA检测血清中IgG抗体，结果显示，3个突变菌免疫后第1周均可以检测到IgG抗体，免疫后第2周达到高峰，此后抗体水平均略有下降。小肠黏膜抗体slgA的检测结果显示，C50041AspiC免疫组在免疫后第2周可以检测到slgA抗体，而C50041Acrp和C50041AcrpdspiC／Km免疫组在第3周方可检测到。将3株缺失菌以肌肉注射方式免疫3日龄雏鸡，同时设立PBS对照组，免疫后第8天，以2．1×109CFU的肠炎沙门菌野生株攻毒，粪便中沙门菌含量结果显示，3个免疫组与PBS组之间存在极显著差异p<0．0

7、1)；肝脏、脾脏中野生菌带菌量检测结果显示，3个免疫组与PBS组相比存在极显著差异⑦<0．01)，且PBS组肝脏、脾脏中野生菌持续时间更久。关键词：肠炎沙门菌C50041，spiC基因，crp基因，减毒活疫苗，同源重组，免疫生物学特性李宝利：肠炎沙门菌C50041crp、spiC基因缺失株的构建及其免疫生物学特性研究三ConstructionofSalmonellaentericaserovarEnteritidisC50041crp，spiCmutantsandtheirimmunobiologicalfeatu