大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位(ltb)对罗非鱼链球菌口服疫苗免疫增强效果的初步研究

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1、分类号—白虹UDC硕士学位论文大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)对罗非鱼链球菌口服疫苗免疫增强效果的初步研究施金谷学科专业丞主差殖指导教师黄丝塾拯论文答辩日期2Q!圣：Q墨：2三学位授予日期超丝：芝Z：磁答辩委员会主席汪建国塾拯广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除己特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的

2、研究工作所做的贡献均己在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：口保密，在年解密后适用授权。坏保密。(请在以上相应方框内打“、／”)论文作者签名：趔砂金给指导教师签名：蕴幻日期：2013．05．23日期20

3、13．05．23电子邮箱：sj977@163．com大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)对罗非鱼链球菌口服疫苗免疫增强效果的初步研究摘要口服免疫是一种简单而有效诱导粘膜免疫的免疫方式，但由于缺乏良好的运输系统和吸收系统，很大程度上限制了口服疫苗的发展。大肠毒素不耐热肠毒素B亚单位(LTB)是一个强有力的调节免疫的信号和载体分子，因而通常被作为佐剂应用于口服疫苗。为了研究LTB对罗非鱼链球菌口服疫苗的免疫增强效果，本研究通过对已构建的LTB重组酵母进行诱导表达，探索重组LTB最佳表达时间并检测其安全性，并建立罗非

4、鱼抗体检测间接ELISA方法，为罗非鱼抗体的检测奠定了基础，最后将LTB与链球菌口服疫苗联合口服免疫罗非鱼，研究LTB对罗非鱼的免疫增强效果，为链球菌口服疫苗免疫佐剂开发利用提供数据参考。本实验通过对已构建的重组LTBKM71毕赤酵母进行诱导表达以及LTB毒性实验，探讨重组LTB的最佳表达时间以及表达量，检测了LTB对罗非鱼的安全性。实验显示，重组LTB在毕赤酵母中得到有效表达，最佳的表达p,-tfB-J为96h，表达量为2．716mg／mL。LTB对罗非鱼在灌胃初期具有轻微刺激性，但能够作为罗非鱼肠道粘膜佐剂使

5、用。在罗非鱼血清及粘膜抗体水平间接ELISA检测方法建立的实验中发现，罗非鱼血清抗体间接ELISA检测的最佳反应温度为22。C，抗原包被浓度为5．5pg／mL，待测血清、多抗的稀释度和酶标二抗的稀释度分别为1／400、1／2000和1／8000。在对LTB的免疫增强效果研究的试验中，以罗非鱼链球菌口服疫苗O．2×109cells／尾、O．2×108cells／尾和O．2×107cells／尾三个口服剂量水平以及LTB口服剂量1．6899／N、O．841．tg／尾和0．17pg／尾3个处理水平设计联合疫苗，并通过口

6、服免疫罗非鱼，评价LTB的免疫增强效果及联合疫苗相对保护率。结果表明，LTB能够促进血清以及肠道粘膜抗体水平，对链球菌口服疫苗有佐剂效应。当疫苗口服剂量为O．2×108cells／尾，LTB口服剂量为O．8499／N的组合时达到最佳免疫效果，该组合能在免疫后期稳定持续高效的提高血清和肠道粘膜抗体应答水平，并且使罗非鱼在免疫后第10d、20d和30d相对保护率分别达到65．00％、68．42％和64．71％。肠道粘膜抗体水平和LTB的含量成正比，但在免疫期内同一LTB含量实验组的抗体水平波动幅度较大。检测LTB对罗

7、非鱼非特异性免疫效应的影响，发现LTB可显著提高溶菌酶和碱性磷酸酶水平，对酸性磷酸酶无显著影响，但对超氧化物歧化酶表现出抑制作用。实验结果表明，LTB虽然对罗非鱼灌胃前期具有微弱刺激性，但总体可提高鱼体的免疫力，与罗非鱼链球菌口服疫苗联合时，可明显提高509～609罗非鱼链球菌口服疫苗的免疫效果，提高血清和肠道粘膜免疫水平，是一种具有潜力的口服疫苗免疫佐剂。关键涧：大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位链球菌口服疫苗罗非鱼THEEFFECTSOFHEAT．LABILEENTEROTOXINBSUBUNITOFESCHERI

8、CHIACOLI(LTB)ONORALVACCINATIONOFS删EINTILAPIAABSTRACTOralvaccinationisasimple，efficientwayofinducingimmunityatmucosalsurfaces．Theslowdevelopmentoforalvaccineshasbeenmainlyduetothelackofsui