小鼠肝癌细胞中annexin a7相互作用蛋白的鉴定

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1、中图分类号密级小鼠肝癌细胞中AnnexinA7相互作用蛋白的鉴定TargetedproteomicanalysisofAnnexinA7inmousehepatocarcinomacells计：学位论文：101页表格：3个插图：17幅杜钺指导教师：唐建武教授申请学位级别：博士学位学科(专业)：病理学与病理生理学培养单位：大连医科大学完成时间：二O一三年四月答辩委员会主席：＼删煅独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的

2、研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：生兰氩签字日期：弦仔年5-月2,o日关于学位论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于(请在以下相应方框内打“4

3、”)：1．保密口，在一年解密后适用本授权书。2．不保密区作者签名：枉钺日期：如B年厂月如日导师签名：日期：年月日目录一、摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(一)中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(二)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3二、正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯一OilDOODD⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6(一)前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6(一)日!J舌⋯⋯一“⋯”⋯⋯⋯⋯”“一一”⋯⋯““⋯⋯⋯”一一一⋯“⋯⋯第一部分液质联用鉴定与Annexin

4、A7共沉淀蛋白(二)材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．细胞系和仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82．方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯···⋯⋯⋯⋯⋯··⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯···⋯82．1AnnexinA7Immunoprecipitaion和SDSPAGE⋯⋯82．2应用LC．MS／MS鉴定与AnnexinA7共沉淀蛋白⋯⋯⋯8(三)结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．电泳分离Hca．F细胞中AnnexinA7的免疫沉淀产物⋯⋯⋯92．猎物条带的胶内酶切及质谱鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9(四)讨论⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11(五)总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12第二部分AnnexinA7与Plectin、RACKl形成蛋白复合体(二)材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯131．细胞系和仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯OOg⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．1AnnexinA7Immunoprecipitaion矛口SDSPAGE⋯⋯⋯132．2WesternBlotting⋯⋯⋯⋯⋯⋯···⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．3激光共聚焦细胞成像

6、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13(三)结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯141．AnnexinA7与Plectin、IntegrinQ3和IntegrinB1共沉淀⋯142．RACKl存在于AnnexinA7IP产物中⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯143．激光共聚焦成像⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14(四)讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15(五)总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16第三部分用于GSTpull．downassay的GST—AnnexinA7融合蛋白的原核表达(二)材料和方

7、法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯171．菌株和仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172．方法⋯⋯··⋯·⋯⋯⋯··⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯···⋯·⋯·⋯⋯⋯··172．1重组质粒PGEX．2T．AnnexinA7的筛选和扩增⋯⋯⋯⋯⋯172．2重组质粒PGEX．2T—AnnexinA7的酶切验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯172．3重组质粒PGEX一2T。AnnexinA7的DNA序列测定⋯⋯⋯182．4分别诱导表达GST和GSTtaggedAnnexinA7⋯⋯⋯⋯⋯182．5WB鉴定GST和GST．AnnexinA7蛋白的纯化效果⋯⋯⋯

8、19(三)结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯191．重组质粒的酶切验证和测序结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．IPTG诱导空载体转化的E．coliBL21表达