广州市男男性行为者中hiv-1感染者的基因亚型和耐药性研究

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广东药科大学硕士研究生毕业论文分类号：___________密级:___________UDC:___________广州市男男性行为者中HIV-1感染者的基因亚型和耐药性研究姓名：张亚丽学号：2111541048院系：公共卫生学院专业：公共卫生专硕研究方向：疾病预防与控制导师姓名：夏云副教授韩志刚副主任医师论文提交日期：2018年3月15日论文答辩日期：2018年5月17日学位授予单位：广东药科大学二○一八年五月 广东药科大学硕士研究生毕业论文I 广东药科大学硕士研究生毕业论文StudyonHIV-1SubtypeandDrugResistanceinMenWhohaveSexwithMeninGuangzhouCandidate：ZhangYaliStudentID：2111541048Affiliation：SchoolofPublicHealthAcademicDegreeApliedfor：MasterofMedicineSpeciality：PublicHealthSupervisor：Pro.XiaYunAssistantSupervisor：Pro.HanZhigangDayofDefence：May2018Degree-Conferring-Institution：GuangdongPharmaceuticalUniversityMay2018II 广东药科大学硕士研究生毕业论文III 广东药科大学硕士研究生毕业论文IV 广东药科大学硕士研究生毕业论文V 广东药科大学硕士研究生毕业论文广州市男男性行为者中HIV-1感染者的基因亚型和耐药性研究摘要目的：分析2008~2015年广州市男男性行为者（Menwhohavesexwithmen,MSM）中艾滋病病毒Ⅰ型（Humanimmunodeficiencyvirustype1,HIV-1）感染者的基因亚型和耐药性（Drugresistance,DR）的分布特征与流行趋势。方法：收集现住址为广州市、经男男性行为途径传播感染、2008~2015年在广州市新确证为HIV-1抗体阳性且样本量大于140µl的血清样本。从收集的血清样本中提取HIV-1病毒RNA，采用巢式聚合酶链反应（Polymerasechainreaction,PCR）扩增病毒RNA的pol区全部蛋白酶基因（PR）和部分逆转录酶基因（RT）序列片段，将扩增成功的PCR产物送至第三方检测公司进行测序，测序结果通过Chromas软件进行查看、编辑和拼接。HIV-1基因亚型通过FastTree2.1.8软件的最大似然法（Maximum-likelihood,ML）构建系统进化树进行确定，HIV-1耐药情况通过将拼接成功的序列导入美国斯坦福大学HIV耐药数据库（http://hivdb.stanford.edu）中使用HIVdb程序进行确定。使用SPSS20.0软件对所得数据进行统计学分析。结果：1.一般情况：根据纳入标准，基因亚型研究选取血清样本2473份，成功扩增2210份，2210份样本人群的平均年龄为30.19±8.22岁，最小16岁，最大84岁；汉族和未婚人群所占比率较高，分别为90.81%和73.39%。未接受抗病毒治疗的血清样本2283份，成功扩增I 广东药科大学硕士研究生毕业论文用于耐药性检测样本1986份，1986份样本人群的平均年龄30.18±8.24岁。2.HIV-1基因亚型分布情况：2008~2015年广州市MSM者中新确证的HIV-1感染者中存在多种HIV-1基因亚型，其中以CRF07_BC和CRF01_AE亚型所占比率较高，分别为38.22%和34.49%；其次为CRF55_01B、B、URFs、CRF59_01B和其他亚型，所占比率分别为14.62%、6.06%、3.58%、2.17%和0.63%。在不同年份间差异具有统计学意义的基因亚型有B、CRF55_01B、CRF07_BC和URFs亚型，其中B亚型在所有亚型中所占比率在2008~2015年间呈逐年下降趋势（P＜0.001），URFs亚型呈逐年上升趋势（P＜0.000）。且在不同职业人群中，URFs在农民及农民工中所占比率最高，为9.26%。3.耐药性流行情况：2008~2015年在广州市新确证为HIV-1抗体阳性且未接受过抗病毒治疗的MSM者中HIV-1总耐药率为3.32%，其中蛋白酶抑制剂（PIs）、核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）和非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs）三类药物耐药率分别为1.36%、0.65%和1.61%。所有亚型中B亚型对三类药物的耐药率均较高，其中对D4T、EFV和NVP三种药物耐药率最高，均为4.17%，其次为NFV、AZT和RPV，均为3.33%。CRF55_01B对NNRTIs的耐药率较高，尤其对EFV和NVP两种药物耐药率最高，均达到5.50%，ETR和RPV次之，均为5.15%。结论：1.2008~2015年广州市MSM者中HIV-1基因亚型分布表现为CRF07_BC和CRF01_AE为主且多种亚型并存的特点。其中URFs亚型所占比率呈逐年上升趋势，提示HIV-1在MSM者中发生过不断重组，应针对多性伴者和流动人口加强干预。2.本次研究结果显示2008~2015年广州市MSM者中未接受抗病II 广东药科大学硕士研究生毕业论文毒治疗的HIV-1感染者的总耐药率为3.32%，尚处于较低水平，但B亚型和CRF55_01B亚型耐药率相对较高，值得引起关注。关键词:艾滋病病毒Ⅰ型；男男性行为者；亚型；耐药III 广东药科大学硕士研究生毕业论文IV 广东药科大学硕士研究生毕业论文StudyonHIV-1SubtypeandDrugResistanceinMenWhohaveSexwithMeninGuangzhouABSTRACTObjective:TostudythedistributioncharacteristicsandepidemictrendofHIV-1subtypesanddrugresistance(DR)inmenwhohavesexwithmen(MSM)inGuangzhoufrom2008to2015.Methods:CollectingserumsamplesfromHIV-1positivepeoplewhoinfectedfrommenwhohavesexwithmen,newlyconfirmedorhavenotreceivedantiretroviraltreatmentfrom2008to2015inGuangzhou.ThevirusRNAwasextractedfromthecollectedserumsamples.Thewholeproteasegene(PR)andpartialreversetranscriptasegene(RT)sequenceofpolregionofvirusRNAwereamplifiedbynestedpolymerasechainreaction(PCR).ChromaswasusedtoeditandsplicePCRproducts,andMLofFastTree2.1.8wasusedtostructurephylogenetictree.ThegenesubtypesofHIV-1andthedistributionofHIV-1genesubtypesindifferentyearsanddifferentcharacteristicscanbedeterminedbyphylogenetictree.ThenthesequenceofthesplicedsequencecouldbeimportedintotheresistancesequenceanalysistoolofStanfordUniversityHIVresistancedatabase(http://hivdb.stanford.edu)toidentifytheresistancelocusanddrugresistancedegreeofthevirus.SPSS20softwarewasusedtomakestatisticalanalysisofthedata.V 广东药科大学硕士研究生毕业论文Results:1.Generalsituation:Accordingtotheselectioncriteria,2473newlyconfirmedserumsamplesofHIV-1positiveantibodyweresuccessfullyamplified,and2210copiesweresuccessfullyamplified.Theaverageageof2210populationwas30.19yearsold,mainlyinyoungadults.TheproportionofHanandunmarriedpopulationwas90.81%and73.39%,respectively.InthenewlyconfirmedHIV-1positivesamples,2,283serumsamplesthatdidnotreceiveantiviraltreatmentwerecollected,andacquired1,986polregiontargetgenefragments.Thetheaverageageofthe1986samplepopulationwas30.18yearsold,andtheratioofunmarriedandHanpeoplewasrelativelyhigh,74.17%and90.63%,respectively.2.DistributionofHIV-1subtypes:ThereareseveralHIV-1subtypesinthenewlyconfirmedHIV-1infectedpeopleofMSMinGuangzhoufrom2008to2015.Amongthem,theproportionofCRF07_BCandCRF01_AEsubtypeswas38.22%and34.49%respectively,followedbyCRF55_01B,B,URFs,CRF59_01Bandothersubtypes,accountingfor14.62%,6.06%,3.58%,2.17%and0.63%respectively.SubtypeswithstatisticallysignificantconstituentratiosindifferentyearswereB,CRF55_01B,CRF07_BCandURFssubtypes.TheconstituentratioofBsubtypedecreasedyearbyyearin2008~2015(P=0.000,99%CI:0.000~0.000).TheconstituentratioofURFssubtypeincreasedyearbyyearin2008~2015(P=0.000,99%CI:0.000~0.000).Amongthefarmers,migrantworkersandmultiplesexpartners,theproportionofURFswassignificantlyhigherthanthatofnonmigrantworkersandnonsexpartners.3.Theprevalenceofdrugresistance:Thetotaldrugresistancerateofthisstudywas3.3%,ofwhichthedrugresistanceratesofPIs,NRTIsandNNRTIswere1.36%,0.65%and1.61%,respectively.TheresistancerateVI 广东药科大学硕士研究生毕业论文oftheBsubtypetothreekindsofdrugswashigh,andtheresistancerateforD4T,EFVandNVPwasthehighest,all4.17%,followedbyNFV,AZTandRPV,all3.33%.TheresistancerateofCRF55_01BtoNNRTIswashigherthanthatofothersubtypes,andtherateofresistancetoEFVandNVPwasthehighest,whichwas5.50%,followedbyETRandRPV,whichwereall5.15%.Conclusion:1.TheaverageageofHIV-1infectedpeopleinMSMinGuangzhouwasabout30yearsoldfrom2008to2015,whichwasconsistentwiththeresultsofpreviousstudiesofotherprovincesandcities.ItsuggestedthatyoungpeoplearestillthemainpopulationofAIDSpreventionandcontrol.ItisnecessarytostrengthenhealtheducationandpropagandaaboutAIDSinthisagegroup.2.ThecompositionratioofURFssubtypeintheHIV-1infectedpeopleofMSMinGuangzhouwasincreasingyearbyyearin2008~2015.ItissuggestedthatmultiplesubtypesofHIV-1havebeenreorganizedinthispopulation.TheoccurrenceofthisphenomenonmayberelatedtothelargerpopulationmobilityinGuangzhouandthehigherratioofMSMsexpartners.WeshouldstrengthentheinterventionoffarmersandmigrantworkersandpeoplewithmultiplesexpartnersintheGuangzhouMSM.3.ThetransmitteddrugresistancerateofHIV-1infectedpeoplewhohadnotreceivedantiviraltreatmentinGuangzhouin2008~2015wasstillatalowlevel.Theexistingdrugsarestillapplicabletothepopulationingeneral.However,thedrugresistancerateofBsubtypeandCRF55_01Bsubtypewererelativelyhighcomparedwithothersubtypes,whichneedstobepaidattentiontoearly.Keywords:HumanimmunodeficiencyvirusⅠtype(HIV-1);Menwhohavesexwithmen(MSM);Subtype;DrugresistanceVII 广东药科大学硕士研究生毕业论文VIII 广东药科大学硕士研究生毕业论文目录前言............................................................1第一章广州市MSM者中新确证HIV-1感染者的基因亚型分布特征.....51.1实验材料...................................................51.1.1研究对象...........................................................................................................51.1.2主要试剂...........................................................................................................51.1.3主要仪器设备...................................................................................................51.1.4主要软件与相关工具.......................................................................................61.2实验方法...................................................61.2.1HIV-1抗体检测.................................................................................................61.2.2病毒RNA提取..................................................................................................61.2.3pol区基因扩增.................................................................................................71.2.3.1扩增引物....................................................................................................71.23.2扩增条件....................................................................................................81.2.4扩增产物鉴定...................................................................................................91.2.5扩增产物测序...................................................................................................91.2.6序列校正与拼接.............................................................................................101.2.7HIV-1基因亚型的确定...................................................................................101.2.8统计学分析.....................................................................................................101.2.9伦理学问题.....................................................................................................101.3结果......................................................111.3.1人口学特征.....................................................................................................111.3.2HIV-1基因亚型分布.......................................................................................111.3.3不同特征样本人群的HIV-1基因亚型分布..................................................121.3.4HIV-1基因亚型随时间变化趋势...................................................................161.4讨论......................................................19第二章广州市MSM者中未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者耐药性分布特征和流行趋势.........................................................212.1实验材料..................................................212.1.1研究对象.........................................................................................................21IX 广东药科大学硕士研究生毕业论文2.1.2主要试剂和仪器设备.....................................................................................212.1.3主要软件与相关工具.....................................................................................212.2实验方法..................................................212.2.1耐药性分析.....................................................................................................212.2.2统计分析.........................................................................................................222.3结果......................................................222.3.1人口学特征.....................................................................................................222.3.2不同特征样本人群的耐药情况.....................................................................232.3.3耐药毒株突变情况.........................................................................................272.3.4基因亚型与抗病毒药物之间的关系.............................................................292.4讨论......................................................31第三章小结...................................................333.1本研究的主要结论...........................................333.2本研究创新之处.............................................333.3本研究不足之处.............................................33第四章综述HIV-1基因亚型和耐药性的研究现状.................394.1HIV-1病毒基本结构........................................394.2HIV-1基因分型............................................404.3HIV-1抗病毒治疗和耐药....................................404.4HIV耐药目前流行情况......................................414.5小结......................................................42附录...........................................................46致谢...........................................................47硕士期间发表论文...............................................47X 广东药科大学硕士研究生毕业论文前言艾滋病（Acquiredimmunedeficiencysyndrome,AIDS）是由艾滋病病毒（Humanimmunodeficiencyvirus,HIV）感染引起的一种主要破坏人体免疫系统的乙类烈性传染病，目前已成为全球关注的重点公共卫生问题之一。据世界卫生组织（Worldhealthorganization,WHO）最新报告数据显示，截至到2016年底，全球有现存活HIV感染者/AIDS病人（PeoplelivingwithHIV/AIDS,PLWHA）约[1]3670万例，其中2016年新发感染者约180万，死亡人数约100万。我国艾滋病疫情经历了1985年开始的输入性散发期，到1989年开始的局部流行期，再到1995年开始的广泛流行期。截至2017年12月31日，我国累计报告现存活PLWHA约75.9万例，比2016年增加93859例；其中2017年新发感染者约13.5万例，[2,3]比2016年增加9957例。HIV-1属于逆转录病毒科（Retroviridae）和慢病毒属（Lentivirus），是一种单链RNA病毒，其复制主要经过逆转录的方式，由于生物学上的逆转录酶缺乏矫正功能，因此HIV-1的RNA在复制过程中容易发生基因突变，生成具有多种亚型的病毒株。根据核酸序列的同源性分析，HIV-1经历了至少四次跨物种传播，形成了HIV-1的M组、N组、O组和P组，其中M组是现今全球范围内主要的流行亚型，也是目前国内外针对HIV-1基因分型研究的主要亚型；N组和O组[4,5]只在非洲局部地区少有发现；P组目前尚未在人群中发现流行。再对目前主要研究的M组亚型进行分类发现，M组包括9种单纯亚型（Subtype）和若干重[6,7]组亚型（Recombinantforms,RFs），9种单纯亚型分别是A~D、F~H、J和K，其中A亚型和F亚型又可分别分为A1、A2和F1、F2；RFs主要有独特重组型（Uniquerecombinantforms,URFs）和流行重组型（Circulatingrecombinantforms,CRFs）两种，其中URFs是几种亚型通过重组变异形成的，CRFs是URFs在多[8-10]个没有流行病学关联的人群中经过多次重组形成的。目前在人群中流行的艾滋病病毒少有单纯的一种亚型，多数是几种亚型的重组型，根据HIVDatabase每年更新的数据显示，截止到2017年底，全球已经发现84种RFs（https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/CRFs/CRFs.html#CRF66）。多种重组形式的持续产生和流行，使HIV-1的预防与控制也更加严峻。HIV-1的传播途径主要有三种：血液传播、母婴传播和性传播。近年来，HIV-1在我国的主要传播途径发生了明显转变，以往的血液传播逐渐被性传播取代，尤其是经男男性行为途径的传播呈明显上升趋势。有研究数据显示，以2004年为分界点，我国HIV-1感染者中经血液传播感染的比率明显减少，经异性传播途径1 广东药科大学硕士研究生毕业论文[11,感染的比率基本维持不变，经男男同性性行为途径传播感染的比例明显增加12]。全国艾滋病综合防治信息系统中的数据报告显示，我国PLWHA新发现人群[2,13]中MSM者所占比率从2010年的13.2%上升到2017年的25.5%，其中2011[3,14]年和2015年的新发感染者中MSM者所占比率分别达到26.6%和27.6%。广州市作为华南地区经济贸易中心，外来人口流通量较大，思想比较开放，MSM者所占的比率相对较高。已有数据统计，2008年广州市HIV-1感染者中MSM者所占比例为5.0%，2013年所占比率已经达到11.4%，2014年达到50.5%，所占[15]比率首次超过异性传播人群。目前MSM者已成为广州市艾滋病预防控制的重点人群。已有研究证明，不同传播途径的HIV-1感染者中HIV-1基因亚型在也存在一定差异，例如血液传播为主的感染者中主要流行基因型为B亚型，性传播为主[12,16]的感染者中主要流行亚型为AE亚型。我国HIV-1基因亚型整体流行现状为AE亚型为主，B亚型和BC亚型次之，但近年来数据显示，我国HIV-1亚型的[12]整体流行趋势表现为B亚型逐年减少，AE亚型逐年增加，这与我国经性传播感染人群所占比率呈逐年增加趋势有密切关系，尤其是经男男性行为途径感染者所占比率的增加。且有目前最新调查发现，我国MSM者中相继出现CRF55_01B、[17,18]CRF59_01B、CRF67_01B和CRF68_01B等新型HIV-1重组亚型，因此，MSM者不仅是所占比率逐渐增加的艾滋病高危人群，更是HIV-1新型重组亚型的“孵化器”。高效联合抗逆转录病毒疗法(Highactiveanti-retroviraltherapy，HAART)是目前用于治疗艾滋病最有效的方法，其将多种能抑制病毒不同复制环节的抗病毒药物联合使用，有效抑制艾滋病病毒的复制，使艾滋病从一个被称为“超级癌症”、死亡率最高的疾病，变成了一个可治疗的慢性病，不仅极大程度增加了PLWHA[19-21]的存活率，更有效抑制了HIV的传播。但是，HIV是目前已知变异最快的病毒，即使在多种药物联合使用的情况下，随着HAART的不断推广和深入，HIV-1在抗病毒药物的选择压力下，通过其本身具有的高度变异性，逐渐产生对药物具有抑制作用变异毒株，出现对药物敏感性降低或不敏感的现象，出现针对现有药物的耐药毒株。目前针对艾滋病的耐药形式主要有两种：传播耐药（Transmitteddrugresistance，TDR）又称原发耐药，以及获得耐药(Acquireddrugresistance,ADR)又称继发耐药。TDR是指病人在接受抗病毒治疗前，其体内病毒株已经具有对某些药物耐药性，或感染的病毒株已经具有耐药性，因此产生对初次使用的抗病毒药物敏感性降低的一种耐药形式，在已经开展HAART的国家和地区普遍存在TDR；ADR是指感染者体内病毒开始不耐药，在接受抗病毒治疗过程中，由于药物选择压力逐渐突变成耐药毒株而形成的耐药形式。耐药毒株的传播会降低抗病毒药物的敏感性，使患者可选择的药物种类越来越少，导致抗病毒治疗失败，2 广东药科大学硕士研究生毕业论文是目前艾滋病抗病毒治疗面临的最严峻的问题之一。在HIV-1新发感染者中，若感染的毒株已经具有耐药性，则新发感染者尚未接受抗病毒治疗已经对某些药物产生耐药，正引起越来越多的关注。因此对HIV-1新发感染者中耐药毒株的流行情况进行研究，及早掌握HIV耐药突变的发生情况和流行趋势，对抗病毒治疗方案的预测以及提高抗病毒药物的疗效都具有重要的指导意义。耐药毒株不仅使[22]抗逆转录病毒药物的敏感性降低，甚至会直接导致临床抗病毒治疗失败，更为严重的是耐药毒株的传播，如果耐药毒株在人群中形成大流行，则艾滋病会出现有药也无法治的状况。因此，除了对正在接受抗病毒治疗的HIV-1感染者开展耐药监测，对尚未治疗的感染者开展耐药检测同样具有重要的公共卫生意义。自HAART在我国用于艾滋病治疗以来，我国与艾滋病相关的死亡率明显下降，但随之而来的HIV-1耐药毒株的出现与传播，给我国艾滋病的防治工作带来[23,24]了新的挑战。在2015年7月举办的第20届世界艾滋病大会上，世界卫生组织（Worldhealthorganization,WHO）提出了“3个90”的艾滋病防治目标，即到2020年实现90%的HIV感染者能通过检测了解自己的感染情况，90%的感染者能接受相应的临床治疗，90%接受临床治疗的感染者体内病毒可以得到有效抑制。为响应“3个90”计划，世界各国开始扩大艾滋病的治疗规模，我国于2016年开始实施“发现就治疗”的策略，这将使新发感染者中感染耐药毒株的比率更[25]高，为此WHO制定了全球行动计划以应对HIV耐药的挑战，中国疾病预防控制中心也于2003年开始针对艾滋病病毒耐药毒株的研究计划。目前我国用于艾滋病免费抗病毒治疗的药物主要有三大类共九种，三大类分别是蛋白酶抑制剂（PIs）、核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）和非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs）。其中PIs类药物主要有那韦利托那韦（LPV/r）和印地那韦（IDV/r）；NRTIs包括拉米夫定（3TC）、替诺福韦（TDF）、齐多夫定（AZT）、去羟肌苷（DDI）和司他夫定（D4T）；NNRTIs包括依非韦伦（EFV）和奈韦拉平（NVP）。面对有限的药物和不断增加的耐药毒株，要长期保证治疗患者健康存活，唯一能做的就是做好艾滋病病毒耐药毒株的预防与监测。综上所述，HIV-1的不同基因亚型与重组型在疾病的传播、病程的发展和药物的耐受等方面均表现出不同的特征，这些特征既是艾滋病抗病毒治疗工作顺利进展的主要障碍之一，也是艾滋病预防控制的重要参考，同时，耐药毒株监测与检测不仅可以帮助公共卫生人员了解耐药毒株传播的现状与趋势，以制定相应的公共卫生防治策略，还可以帮助临床医生选择有效的抗病毒治疗药物。鉴于此，本研究选择2008~2015年住址为广州市的MSM者中新确证的HIV-1感染者为研究对象，研究HIV-1基因亚型和耐药性在该人群中的分布特征与流行趋势。3 广东药科大学硕士研究生毕业论文4 广东药科大学硕士研究生毕业论文第一章新确证HIV-1感染者的基因亚型分布特征1.1实验材料1.1.1研究对象本次研究的样本来自广州市各HIV初筛实验室送至广州市疾病预防控制中心（CDC）艾滋病确证实验室做确证的血清样本。样本纳入标准为：现住址为广州市（不包括港澳台及外籍病例）、2008~2015年在广州市新确证为HIV-1抗体阳性、经男男性行为途径传播感染和血清样本量大于140µl。PCR扩增失败的样本不纳入本次研究。本次样本人群的流行病学信息均来自国家艾滋病综合防治信息系统，包括年龄、种族、职业和文化程度等。1.1.2主要试剂（1）核酸提取试剂盒：QIAampViralRNAMiniKit，德国Qiagen公司（250人次）TM（2）第一轮PCR试剂：PrimeScriptOneStepRT-PCRKit，大连宝生物工程有限公司（TaKaRa)（3）第二轮PCR试剂：PremixExTaq，大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）（4）PCR去离子水：RNasefree，大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）（5）10×TBE缓冲液：GMS2021，上海宝曼生物科技有限公司（6）琼脂糖：上海生工生物工程有限公司（7）凝胶染料：SYBRSafeDNAGelStain（8）6LoadingBuffer：大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）（9）500bpDNAMarker：大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）1.1.3主要仪器设备（1）台式高速离心机：Eppendorfeentrifuge5417（2）PCR基因扩增热循环仪：ABI9700（3）化学发光凝胶成像分析系统：FluorChemFC3（4）电泳仪及电泳槽：DYY-8C（北京市六一仪器厂）（5）生物安全柜：美国Thermoforma公司（6）低温冰箱：日本三洋公司（7）西门子普通冰箱：德国西门子公司5 广东药科大学硕士研究生毕业论文（8）电子天平：setraEL-200s（9）微量加样器：德国Eppendorf1.1.4主要软件与相关工具（1）Chromas2.6.2：序列阅读和编辑（2）ChromasPro1.7.6：序列矫正和拼接（3）MEGA6.06：序列比对（4）FastTree2.1.8：利用最大似然法构建系统进化树（5）FigTreev1.4.2：编辑系统进化树软件（6）LosAlamosHIVdatabases：提供亚型参考株（7）RIP：重组检测（7）SPSS20.0：统计学分析1.2实验方法1.2.1HIV-1抗体检测所有血清样本均经过酶联免疫法（Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）和免疫蛋白印迹法（Westernblot，WB）确证为HIV-1抗体阳性。1.2.2病毒RNA提取（1）实验前准备1）根据样本清单从低温冰箱中取出对应的血清样本，放置4℃冰箱中，解冻待用。2）将CarrierRNA干粉冻存管8000rmp离心10秒钟，然后加入310µlBufferAVE，充分溶解混匀，配制成1ng/ml的溶液，以每管70µl分装于多个1.5ml冻存管中，-20℃保存。配制好的CarrierRNA-AVE冻融不能超过3次。3）AW1中加入125ml无水乙醇，AW2中加入160ml无水乙醇，混匀后做标记并室温保存，每次使用前需充分混匀。（2）实验步骤1）按照每0.56mlBufferAVL中加入5.6µlCarrierRNA-AVE的比率配置样本液，充分混匀后以每支560µl分装于1.5ml离心管中。2）将4℃冰箱中融化的血清样本8000rmp离心10秒钟，取140µl移置离心管的560µl样本液中，混匀震荡15秒后室温（25±5℃）孵育10分钟。3）于第二步离心管中加入560µl无水乙醇，混匀震荡15秒后8000rmp离心10秒钟。6 广东药科大学硕士研究生毕业论文4）从第三步离心管中取630µl混合液到对应编号的纯化柱中，切勿挂壁，关盖8000rpm离心1分钟。换新接收管后重复此步操作一次。5）于上一步纯化柱中加入500µlAW1，8000rmp离心1分钟，换上新接收管，再加入500µlAW2，14000rpm离心3分钟。6）用剪掉管口的离心管替换掉接收管，对准滤膜中心加入60µlBufferAVE，室温（25±5℃）孵育1分钟后再8000rpm离心1分钟，收集滤液。7）将滤液移至RNA冻存管中，-80℃低温冰箱保存。（3）注意事项1）本次研究所有样本均为HIV-1阳性血清，操作中需注意自我防护，所有操作均需要在生物安全柜中完成。若有血清样本溅出，需立即用0.5%次氯酸或90%乙醇消毒。2）由于空气、物体表面和人体唾液等很多地方都存在核糖核酸酶（Ribonuclease,RNase），因此在实验操作过程中需要穿戴实验室规定的工作服、手套和口罩。3）为防止PCR实验室污染，所有操作只能从洁净区到污染区，不能返回。4）实验中的废弃物需要统一高压消毒后再丢弃。1.2.3pol区基因扩增采用巢式聚合酶链反应（Nestedpolymerasechainreaction,PCR）扩增所提取病毒RNA的pol区全部蛋白酶（Protease,PR）基因和部分逆转录酶（Reversetranscriptase,RT）基因片段，扩增片段长度为1743bp（对应HXB2基因组2147~3889位点）。TM第一轮PCR扩增反应使用RT-PCR（PrimeScriptOneStepRT-PCRKit），每个样本反应体系为25µl，包括UltraspecWater5.5µl、2×onestepBuffer12.5µl、MWA260.5µl、PolR400.5µl和病毒RNA5µl，实验目的是以所提取的病毒RNA为模板，合成cDNA。第二轮PCR(PremixExTaq)扩增反应每个样本反应体系为50µl，包括UltraspecWater32.75µl、10×PCRBuffer5.0µl、25mMMgCl24.0µl、25mMdNTP4.0µl、PRO-11.0µl、PolR381.0µl和第一轮逆转录产物2.0µl，实验目的是以第一轮PCR产物cDNA为模板，合成DNA，。1.2.3.1扩增引物第一轮PCR引物使用MAW26和PolR40（5'-CTGTTACTATGTTTACTTCT-3'），第二轮PCR引物使用PRO-1和PolR38。引物序列及位置见表1-1。7 广东药科大学硕士研究生毕业论文表1-1扩增引物一览表引物名称引物序列（5'至3'）相对HXB2的位置用途MAW-265'-TGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3'2029-2050外侧正向PolR405'-CTGTTACTATGTTTACTTCT-3'4041-4022外侧反向PRO-15'-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3'2147-2166内侧正向PolR385'-TTAGCTGCCCCATCTACATAG-3'3889-3869内测反向1.23.2扩增条件扩增条件见表1-2和表1-3。表1-2第一轮PCR扩增反应条件温度（℃）循环时间（min）循环（次数）503019421940.5520.5357237210110foreverforever表1-3第二轮PCR扩增反应条件温度（℃）循环时间（min）循环（次数）9422940.5500.5307237210110foreverforever8 广东药科大学硕士研究生毕业论文1.2.4扩增产物鉴定（1）将10×TBE加入蒸馏水稀释成1×TBE备用。（2）选择适合检测样本量的电泳板，将电泳板和梳子洗净晾干备用。（3）用电子称称取1g琼脂糖粉末，放入三角烧瓶中并加入100ml1×TBE，配置成1%的琼脂糖溶液，将三角烧瓶于微波炉中加热4分钟，使琼脂糖粉末充分溶解，待溶解液冷切到60℃左右时加入10µlSYBR试剂混匀。（4）将混匀后试剂迅速倒入准备好的电泳板中，并插入梳子，室温（25℃）避光放置1小时。（5）在等待琼脂糖凝固的过程中准备跑胶混合液。先于塑料板中每孔加入1µl的LoadingBuffer（TaKaRa，6×）并做标记，再取5ul第二轮PCR产物分别加入对应的孔中，准备好混合液后暂时室温放置。（6）先将梳子从琼脂糖凝胶中缓慢拔出，再将电泳板和凝胶一同放入电泳槽中，确保凝胶的梳齿孔的一面置于电泳槽负极，并且电泳槽中1×TBE溶液略高过凝胶表面。（7）用移液枪分别吸取塑料板中混合液5ul，缓慢依次加入凝胶的梳齿孔中，并在最后一个孔中加入5µl的DNAMarker（TaKaRa）。（8）电泳仪的工作条件为160V，200A，恒压电泳30分钟。（9）电泳结束后，先关电源，再从电泳板上小心取出将琼脂糖凝胶，避免破损，放置空盒中用自来水冲洗3遍，目的是防止凝胶中带出来的TBE电解质溶液腐蚀仪器。（10）将冲洗干净的琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统中，对准镜头在紫外线投射光下观察凝胶上的荧光反应，最后拍照保存。1.2.5扩增产物测序将扩增成功的PCR产物送第三方检测公司（上海美吉生物医学科技有限公司广州分公司）进行纯化和测序，测序引物为：PROC1、RTA、RTB和PolR38。测序引物序列和位置见表1-4。表1-4测序引物一览表引物名称引物序列（5'至3'）相对HXB2的位置ProC15'-CCCTGCTGGGTGTGGTATTCC-3'2846-2826RTA5'-GTTGACTCAGATTGGTTGCAC-3'2519-2539RTB5'-CCTAGTATAAACAATGAGACAC-3'2946-2967PolR385'-TTAGCTGCCCCATCTACATAG-3'3889-38699 广东药科大学硕士研究生毕业论文1.2.6序列校正与拼接首先使用Chromas2.6.2序列文件阅读软件检查测得的序列片段质量，将序列文件两端质量较差序列删除；然后使用MEGA6.06软件将经过上一步处理的序列与来自LosAlamosHIVdatabases的参考序列进行比对，检查序列片段中是否存在碱基多读、漏读或错读，如存在，则根据测序图谱进行校正修改；然后使用ChromasPro1.7.6软件将同一个样本经上述步骤检查过的多个序列片断根据重叠部分进行拼接，并做进一步的检查和校正。1.2.7HIV-1基因亚型的确定从美国LosAlamosHIVdatabases在线数据库（http://www.hiv.lanl.gov)中下载具有时间、传播途径和地域信息的标准参考株，与本次实验获取的基因序列一起通过FastTree2.1.8软件中的最大似然法（Maximum-Likelihood,ML）构建系统进化树，替代模型选择GTR+CAT，SPR=4，分支支持度检测选择Shimodaira-Hasegawa法，构建成功的ML系统进化树使用FigTreev1.4.2软件进行编辑整理，最后根据系统进化树上的拓扑关系确定HIV-1的基因亚型。对于不确定的拓扑关系或重组序列，使用RIP软件进行再次确认与核对，并到美国LosAlamosNationalLaboratory在线数据库的HIVcirculatingrecombinantforms(CRFs)中进行最新流行重组模式的对比（https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/CRFs/CRFs.html）。1.2.8统计学分析2使用SPSS20.0对获得数据进行统计学分析，率的比较使用χ检验，P<0.05为差异有统计学意义。1.2.9伦理学问题本次研究通过了广州市疾病预防控制中心伦理审查委员会的批准。研究设计符合公认的科学准则，研究目的、方法和过程符合保护人类研究对象的基本伦理准则，包括知情同意、隐私权、保密要求、保护特殊人群和评估研究潜在的风险。在实际调查中坚持自愿参与、知情同意及保密的原则，尊重每位被调查者，与每位调查者之间建立充分的信任关系，工作人员在任何情况下不得泄露调查对象的任何个人资料。10 广东药科大学硕士研究生毕业论文1.3结果1.3.1人口学特征本次研究按纳入标准筛选出2473份血清样本，成功扩增2210份pol区目的基因片段，扩增率89.37%。2210份样本人群的平均年龄为30.19±8.22岁，最小16岁，最大84岁，大多数人群集中在21~30岁；汉族和未婚者居多，所占比率分别为90.81%和73.39%；不同职业人群中以服务业居多，所占比率为35.66%；文化程度中以大专及以上者居多，所占比率为48.37%。详见表1-5。表1-52008~2015年广州市MSM者中HIV-1基因亚型分布人口学特征（N=2210）特征人数构成比（%）特征人数构成比（%）年龄（岁）职业≤201376.20服务业78835.6621～30119253.94干部职员1225.5231～4061627.87工人26311.90≥4126511.99农民及农民工542.44婚姻状况家政务及待业1697.65未婚162273.39学生1496.74已婚39918.05专业技术人员954.30离异或丧偶1064.80不详57025.79不详833.75文化程度民族初中及以下48321.86汉族200790.81高中或中专60927.56其他693.12大专及以上106948.37不详1346.06不详492.21性伴数接触史≤291041.13男男性行为212796.243～570334.09男男性行为+其他833.76≥644921.771.3.2HIV-1基因亚型分布2008~2015年广州市MSM者中新确证的HIV-1感染者的基因亚型以CRF07_BC和CRF01_AE所占比率较多，分别为38.10%和34.84%；其次为CRF55_01B、B、URFs、CRF59_01B以及少量其他亚型，所占比率分别为14.62%、11 广东药科大学硕士研究生毕业论文6.06%、3.58%、2.17%和0.63%。其中少量其他亚型包括A1、C、F1、CRF08_BC、CRF54_01B各1例，CRF68_01B亚型2例和CRF67_01B亚型7例。详见图1。图1.HIV-1基因亚型种类分布特征1.3.3不同特征样本人群的HIV-1基因亚型分布通过卡方检验结果显示，不同特征样本人群中HIV-1基因亚型分布具有统计学意义的有：不同年龄段人群中的CRF01_AE和CRF55_01B；不同婚姻状况人群中的CRF01_AE和CRF55_01B；不同文化程度人群中的CRF01_AE和CRF55_01B；不同职业人群中的CRF01_AE、CRF55_01B和URFs；不同性伴数人群中的CRF01_AE和URFs。详见表1-6。将分布差异具有统计学意义，同时率具有上升或下降趋势的样本变量再次做卡方趋势检验发现，在不同年龄组人群中，年龄越大者CRF55_01B亚型所占比2率越高（χ=59.859，P＜0.001）；不同婚姻状况人群中，未婚者CRF01_AE亚型2所占比率高于已婚和离异或丧偶者（χ=8.634，P=0.013），而CRF55_01B亚型所2占比率较低（χ=43.078，P＜0.001）；不同文化程度人群中，文化水平越高者2CRF01_AE亚型所占比率越高（χ=8.114，P=0.004），而CRF55_01B亚型所占比2率越低（χ=15.589，P＜0.001）；不同职业人群中，工人、农民及农民工、家政2家务及待业者中，CRF01_AE亚型所占比率比较低（χ=13.966，P=0.030），而2CRF55_01B的构成比较高（χ=18.168，P=0.006），同时，不同职业人群中，URFs2在农民及农民工感染人群中的所占比率最高（χ=18.168，P=0.017），为9.26%；2不同性伴数人群中，性伴数越多者CRF01_AE亚型所占比率越低（χ=5.745，2P=0.017），而URFs的构成比越高（χ=5.733，P=0.017）。详见表1-7。12 广东药科大学硕士研究生毕业论文表1-6不同特征样本人群的HIV-1基因亚型分布情况例数（n，%）样本特征合计*****BCRF01_AECRF07_BCCRF55_01BCRF59_01BOthersURFs≤208(5.84)48(35.04)59(43.07)9(6.57)6(4.38)0(0.00)7(5.11)137年龄21～3074(6.21)451(37.84)467(39.18)128(10.74)23(1.93)10(0.84)39(3.27)1192组31～4033(5.36)202(32.79)231(37.50)115(18.67)13(2.11)3(0.49)19(3.08)616≥4119(7.17)69(26.04)85(32.08)71(26.79)6(2.26)1(0.38)14(5.28)2652aχ1.16514.8966.19259.8593.4941.0523.927aP0.7610.0020.103＜0.0010.3230.7410.269未婚98(6.04)591(36.44)632(38.96)191(11.78)36(2.22)13(0.80)61(3.76)1622婚姻已婚17(4.26)117(29.32)144(36.09)95(23.81)11(2.76)0(0.00)15(3.76)399状况离异或丧偶8(7.55)31(29.25)38(35.85)24(22.64)1(0.94)1(0.94)3(2.83)1062χ2.5028.6341.39643.0782.4133.7823.450P0.2860.0130.497＜0.0010.4670.2320.332汉族124(6.18)705(35.13)747(37.22)296(14.75)45(2.24)12(0.60)78(3.89)2007民族其他5(7.25)18(26.09)33(47.83)10(14.49)2(2.90)1(1.45)0(0.00)692χ-P0.283*初中及以下31(6.42)144(29.81)189(39.13)86(17.81)17(3.52)4(0.83)12(2.48)483文化高中或中专33(5.42)208(34.15)226(37.11)108(17.73)12(1.97)1(0.16)21(3.45)609程度大专及以上67(6.27)398(37.23)411(38.45)119(11.13)19(1.78)9(0.84)46(4.30)106913 广东药科大学硕士研究生毕业论文续表1-6不同特征样本人群的HIV-1基因亚型分布情况例数（n，%）样本特征合计*****BCRF01_AECRF07_BCCRF55_01BCRF59_01BOthersURFs2aaχ0.6298.1140.51115.5894.895-3.228aaP0.7300.0040.775＜0.0010.0860.306*0.199服务业44(5.58)296(37.56)297(37.69)111(14.09)21(2.66)5(0.63)14(1.78)788干部职员9(7.38)45(36.89)49(40.16)16(13.11)0(0.00)1(0.82)2(1.64)122工人13(4.94)78(29.66)107(40.68)46(17.49)7(2.66)1(0.38)11(4.18)263职业农民及农民工4(7.41)14(25.93)21(38.89)10(18.52)0(0.00)0(0.00)5(9.26)54分组家政家务及待业18(10.65)45(26.63)57(33.73)38(22.49)1(0.59)2(1.18)8(4.73)169学生8(5.37)58(38.93)64(42.95)12(8.05)1(0.67)2(1.34)4(2.68)149专业技术人员9(9.47)34(35.79)39(41.05)9(9.47)0(0.00)0(0.00)4(4.21)952χ10.70213.9664.00618.168--19.856P0.1520.0300.6760.0060.081*0.790*0.017接触男男132(6.21)738(34.70)812(38.18)309(14.53)45(2.12)14(0.66)77(3.62)2127史男男+其他2(2.41)32(38.55)30(36.14)14(16.87)3(3.61)0(0.00)2(2.41)832χ-P0.658≤262(6.81)343(37.69)331(36.37)134(14.73)16(1.76)1(0.11)23(2.53)910性伴3～538(5.41)233(33.14)266(37.84)109(15.50)21(2.99)5(0.71)31(4.41)703数≥626(5.79)142(31.63)184(40.98)58(12.92)10(2.23)7(1.56)22(4.90)4492χ1.4725.7452.7121.4932.69610.1895.733P0.4790.0170.2580.4740.2600.0060.017合计134（6.06）770（34.84）842（38.10）323（14.62）48（2.17）14（0.63）79（3.58）221014 广东药科大学硕士研究生毕业论文续表1-6不同特征样本人群的HIV-1基因亚型分布情况*使用Fisher的精确检验方法；**Other包括A1、C、F1、CRF08_BC、CRF54_01B各1例，CRF67_01B7例和CRF68_01B2例；***URFs表示独特重组模式；a为卡方线性趋势检验结果。15 广东药科大学硕士研究生毕业论文1.3.4HIV-1基因亚型随时间变化趋势本次研究样本的所有亚型中B、CRF07_BC、CRF55_01B和URFs的构成比在2008~2015年不同年份间的差异均有统计学意义（B：P＜0.001；CRF07_BC：22χ=14.965，P=0.036；CRF55_01B：χ=18.161，P=0.011；URFs：P=0.001），其中B亚型的构成比呈逐年下降趋势（P＜0.001），URFs的构成比呈逐年上升趋势（P=0.001）。详见表1-6。本次研究733例25岁及以下感染者中基因亚型同样以CRF07_BC和CRF01_AE为主，所占比率分别为40.52%和37.24%；URFs构成比在2008~2015年不同年份间的差异有统计学意义，且呈逐年上升趋势（P＜0.001），整体流行趋势与MSM者总人群一致。详见表1-7。16 广东药科大学硕士研究生毕业论文表1-72008~2015年广州市MSM者中HIV-1基因亚型随时间变化趋势(N=2210)年份2基因亚型χP20082009201020112012201320142015B10（14.08）21（18.26）9（5.92）14（7.00）13（4.09）16（4.65）28（5.85）23（4.33）-＜0.001CRF01_AE25（35.21）39（33.91）56（36.84）72（36.00）121（38.05）125（36.34）164（34.24）168（31.64）4.6920.697CRF07_BC25（35.21）29（25.22）50（32.89）90（45.00）122（38.36）136（39.53）180（37.58）210（39.55）14.9650.036CRF55_01B9（12.68）25（21.74）33（21.71）17（8.50）48（15.09）44（12.79）72（15.03）75（14.12）18.1610.0110.195CRF59_01B2（2.82）1（0.87）2（1.32）2（1.00）2（0.63）9（2.62）14（2.92）16（3.01）-0.781Others0（0.00）0（0.00）1（0.66）2（1.00）2（0.63）3（0.87）1（0.21）5（0.94）-aURFs0（0.00）0（0.00）1（0.66）3（1.50）10（3.14）11（3.20）20（4.18）34（6.40）-＜0.001合计71（3.21）115（5.20）152（6.88）200（9.05）318（14.39）344（15.57）479（21.67）531（24.03）注：括号外数据为例数，括号内数据为构成比（%）；a表示不同年份间该亚型构成比线性趋势检验结果。17 广东药科大学硕士研究生毕业论文表1-82008~2015年广州市MSM者中25岁以下人群HIV-1基因亚型随时间变化趋势（N=733）年份2基因亚型合计χP20082009201020112012201320142015B43（5.87）2（9.52）4（12.12）3（7.32）5（8.33）2（1.87）5（4.10）13（7.65）9（5.03）-0.266CRF01_AE273（37.24）8（38.10）11（33.33）17（41.46）23（38.33）47（43.93）46（37.70）63（37.06）58（32.40）4.4180.731CRF07_BC297（40.52）11（52.38）13（39.39）14（34.15）24（40.00）47（43.93）56（45.90）62（36.47）70（39.11）5.2270.632CRF55_01B69（9.41）0（0.00）5（15.15）7（17.07）5（8.33）10（9.35）10（8.20）17（10.00）15（8.38）-0.444CRF59_01B17（2.32）0（0.00）0（0.00）0（0.00）0（0.00）0（0.00）2（1.64）7（4.12）8（4.47）-0.078其他6（0.82）0（0.00）0（0.00）0（0.00）1（1.67）0（0.00）1（0.82）1（0.59）3（1.68）-0.802aURFs28（3.82）0（0.00）0（0.00）0（0.00）2（3.33）1（0.93）2（1.64）7（4.12）16（8.94）-＜0.001合计73321334160107122170179注：括号外数据为例数，括号内数据为构成比（%）；a表示不同年份间该亚型构成比线性趋势检验结果。18 广东药科大学硕士研究生毕业论文1.4讨论近年来，随着艾滋病主要传播途径的转变，MSM者逐渐成为我国艾滋病防治工作关注的重点人群，特别是该人群中HIV-1基因亚型分布的变化趋势和重组情况备受关注。2002年有研究结果显示我国MSM者中HIV-1主要流行亚型是B[26]亚型，但2007年以后，该人群中B亚型构成比开始有所下降，而CRF01_AE[27,28]和CRF07_BC亚型的构成比开始上升。本次研究选择2008~2015年，广州市MSM者中在广州地区新确证的HIV-1感染者作为研究对象，发现该人群的HIV-1主要流行亚型为CRF07_BC和CRF01_AE，同时B亚型构成比呈逐年下降趋势，与近年来MSM者中HIV-1亚型的变化趋势一致。同时本次研究发现CRF55_01B、CRF59_01B、CRF67_01B、CRF68_01B和URFs等近年在我国MSM者中新发现的HIV-1重组亚型比率比往年有所增加。其中URFs是HIV-1的多种亚型通过重组变异形成的，其构成比呈增长趋势，意味着HIV-1各种亚型在人群中流行时重组率较高。为证明以上关于URFs的推断结果，本次研究比较了25岁及以下样本人群不同年份HIV-1亚型的分布差异，因为25岁及以下HIV-1感染者经性途径暴露HIV-1的时间较短，可以近似地代表新近感染者，结果进一步证实了广州市MSM者中URFs的构成比在2008~2015年间构成比呈逐年增长趋势。并且农民及农民工和性伴数较多的人群中URFs的构成比在总人群中构成比相对较高，分别为9.26%和4.90%，加强对这些人群的行为干预，对防止新的重组亚型在广州产生和流行具有重要的流行病学意义。文献检索对我国多个省市MSM者中HIV-1基因亚型分布情况分析发现，我国不同地区MSM者中HIV-1的主要流行亚型也存在一定的差异，如北京、山东、江苏、浙江、新疆和云南主要流行亚型为CRF01_AE；重庆、四川和贵州主要为CRF07_BC；湖南、广西和深圳以CRF07_BC和CRF01_AE两种亚型同时存在[29,30]为主。本次研究结果显示，广州市MSM者中HIV-1主要流行亚型的构成比与邻近的湖南、广西以及深圳最为相近，这与广州和这几个省市地理接近、联系密切和人员流动便利有关。综上所述，2008~2015年广州市MSM者中HIV-1基因亚型表现为CRF07_BC和CRF01_AE为主且多种基因亚型共存的特点，应加强对该人群的行为干预，尤其是URFs构成比呈上升趋势的农民及农民工和多性伴人群。19 广东药科大学硕士研究生毕业论文20 广东药科大学硕士研究生毕业论文第二章未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者耐药性分布特征与流行趋势2.1实验材料2.1.1研究对象耐药性研究样本纳入标准为：现住址为广州市（不包括港澳台及外籍病例）、2008~2015年在广州市新确证为HIV-1抗体阳性、经男男性行为途径传播感染、确证时尚未接受过抗病毒治疗和血清样本量大于140µl。PCR扩增失败的样本不纳入本次研究。样本人群的流行病学信息来自我国艾滋病综合防治信息系统，包括年龄、种族、职业和文化程度等。2.1.2主要试剂和仪器设备主要试剂和仪器设备同第一章。2.1.3主要软件与相关工具序列阅读和编辑、序列矫正和拼接、序列比对、利用最大似然法构建系统进化树、编辑系统进化树软件、亚型参考株下载、重组检测和统计学分析软件同第一章。使用美国斯坦福大学HIV耐药数据库http://hivdb.stanford.edu/的HIVdb程序进行HIV-1耐药性分析。2.2实验方法HIV-1抗体检测、病毒RNA提取、pol区目的基因扩增、扩增产物测序与拼接、HIV-1基因亚型的确定和伦理学问题同第一章。2.2.1耐药性分析将拼接好的序列分别以fasta格式保存，提交到美国斯坦福大学HIV耐药数据库提供的耐药序列在线分析软件HIVdbProgramversion8.4（https://hivdb.stanford.edu/hivdb/by-sequences）中进行耐药性分析，寻找耐药相关突变，并做出对蛋白酶抑制剂（Proteaseinhibitors，PIs）、核苷类逆转录酶抑制剂（Nucleosidereversetranscriptaseinhibitors,NRTIs）和非核苷类逆转录酶抑制剂（No-nucleosidereversetranscriptaseinhibitors,NNRTIs）三类药物的21 广东药科大学硕士研究生毕业论文耐药情况。根据2009年WHO公布的监测耐药突变（Surveillancedrugresistancemutations;SDRMs）列表确定耐药突变位点。耐药突变判断标准分为：高度耐药(＞60分），即毒株的耐药基因型与体外型实验证明与耐药程度最高的毒株类似，携带有类似毒株的患者对药物治疗一般很少或没有病毒学反应；中度耐药(30~59分)，即毒株对于药物的耐受程度处于低度耐药和高度耐药之间；低度耐药(15~29分)，即毒株对于药物的敏感性已经降低和（或）患者对治疗的病毒学反应不理想；潜在耐药(10~14分)，即毒株携带有本身不导致耐药的突变，但这些突变的存在显示曾经可能有过药物选择压力的存在；敏感（0~9分），即无证据表明毒株对药物的敏感性降低。各类药物的耐药率为对该类药物的一种或一种以上药物表现出低度及以上耐药水平的样本数占总数的百分比，总耐药率为对任意一种或[31]一种以上药物表现出低度及以上耐药的样本数占总数的百分比。2.2.2统计分析使用SPSS20.0对所获数据软件进行统计学分析，各项构成比和率的比较使2用χ检验，P＜0.05为差异有统计学意义。2.3结果2.3.1人口学特征本次研究根据纳入标准共收集血清样本2283份，成功扩增用于耐药性分析pol区目的基因片段1986份，扩增率86.99%。1986份样本人群平均年龄30.18±8.24岁，最小年龄16岁，最大年龄84岁；婚姻状况以未婚人群为主，占74.17%；文化程度主要为大专及以上，占49.65%；民族主要为汉族，占90.63%；职业种类较多，本次研究占比较多的职业为服务业，占38.82%；接触史主要为男男性行为，占96.42%；性伴数以≤2人者较多，占41.09%。详见表2-1。22 广东药科大学硕士研究生毕业论文表2-1未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者人口学特征（N=1986）特征频数构成比(%)特征频数构成比（%）年龄组(岁)职业20≤1216.09服务业70435.4521～30107153.93干部职员1095.4931～4056028.20工人23011.58≥4123411.78家政家务及待业1477.40婚姻状况农民522.62未婚147374.17学生1356.80已婚有配偶35014.62专业技术人员864.33离异或丧偶934.68不详52326.33不详703.52接触史文化程度男男性行为191596.42初中及以下41520.90男男性行为+其他713.58高中或中专53927.14性伴数大专及以上98649.65≤281641.09不详462.323～563431.92民族≥639419.84汉族180090.63不详1427.15其他633.17不详1236.192.3.2不同特征样本人群的耐药情况本次研究样本人群的总耐药率为3.32%，对PIs、NRTIs和NNRTIs三类药物耐药率分别为1.36%、0.65%和1.61%。其中B亚型和CRF55_01B亚型对三类药物的总耐药率分别为7.50%和6.53%，均高于其他亚型（P=0.000）；B亚型对PIs和NRTIs的耐药率分别为3.33%和4.17%，均高于其他亚型（PIs：P=0.023；NRTIs：P=0.000）；B和CRF55_01B亚型NNRTIs耐药率分别为4.17%和5.50%，均高于其他亚型（P=0.000）。其他不同特征样本人群间耐药率差异无统计学意义。详见表2-2。23 广东药科大学硕士研究生毕业论文表2-2不同特征样本人群的耐药情况分布特征三类药物PIsNRTIsNNRTIs病例特征病例数耐药病例耐药病例(构成比%)耐药病例数2数2耐药病例数2数2χPχPχPχP(耐药率%)(耐药率%)(耐药率%)(耐药率%)年龄组(岁)-0.260-0.197-0.889-0.251≤20121(6.09)5(4.13)4(3.31)1(0.83)2(1.65)21～301071(53.93)29(2.71)14(1.31)6(0.56)13(1.21)31～40560(28.20)20(3.57)5(0.89)5(0.89)10(1.79)≥41234(11.78)12(5.13)4(1.71)1(0.43)7(2.99)婚姻状况-0.838-0.490-0.429-0.732未婚1473(74.17)50(3.39)22(1.49)12(0.81)22(1.49)已婚有配偶350(17.62)12(3.43)4(1.14)1(0.29)7(2.00)离异或丧偶93(4.68)2(2.15)0(0.00)0(0.00)2(2.15)不详70(3.52)2(2.86)1(1.43)0(0.00)1(1.43)文化程度2.0410.3670.2920.864-0.2742.5950.275初中及以下415(20.90)16(3.86)6(1.45)2(0.48)9(2.17)高中或中专539(27.14)20(3.71)6(1.11)6(1.11)10(1.86)大专及以上986(49.65)26(2.64)14(1.42)4(0.41)11(1.12)不详46(2.32)4(8.70)1(2.17)1(2.17)2(4.35)民族-0.055-0.219-0.069-1.00024 广东药科大学硕士研究生毕业论文续表2-2不同特征样本人群的耐药情况分布特征三类药物PIsNRTIsNNRTIs病例特征病例数耐药病例耐药病例(构成比%)耐药病例数2数2耐药病例数2数2χPχPχPχP(耐药率%)(耐药率%)(耐药率%)(耐药率%)汉族1800(90.63)57(3.17)24(1.33)11(0.61)28(1.56)其他63(3.17)5(7.94)2(3.17)2(3.17)1(1.59)不详123(6.19)4(3.25)1(0.81)0(0.00)3(2.44)职业-0.585-0.636-0.895-0.263服务业704(35.45)21(2.72)11(1.43)4(0.52)9(1.17)干部职员109(5.49)1(1.89)1(1.89)0(0.00)0(0.00)工人230(11.58)8(3.24)2(0.81)2(0.81)4(1.62)家政家务及待业147(7.40)7(4.76)1(0.68)2(1.36)5(3.40)农民52(2.62)0(0.00)0(0.00)0(0.00)0(0.00)学生135(6.80)7(5.19)4(2.96)1(0.74)2(1.48)专业技术人员86(4.33)3(3.57)1(1.19)1(1.19)3(3.57)不详523(26.33)19(3.63)7(1.34)3(0.57)9(1.72)接触史-0.171-0.623-1.000-0.413男男性行为1915(96.42)66(3.45)27(1.41)13(0.68)32(1.67)男男性行为+其他71(3.58)0(0.00)0(0.00)0(0.00)0(0.00)性伴数3.7060.1571.4040.496-0.4212.9160.233≤2816(41.09)31(3.80)13(1.59)5(0.61)17(2.08)3～5634(31.92)23(3.63)9(1.42)6(0.95)10(1.58)≥6394(19.84)7(1.78)3(0.76)1(0.25)3(0.76)25 广东药科大学硕士研究生毕业论文续表2-2不同特征样本人群的耐药情况分布特征三类药物PIsNRTIsNNRTIs病例特征病例数耐药病例耐药病例(构成比%)耐药病例数2数2耐药病例数2数2χPχPχPχP(耐药率%)(耐药率%)(耐药率%)(耐药率%)不详142(7.15)5(3.52)2(1.41)1(0.70)2(1.41)＜0.02＜＜病毒亚型----0.00130.0010.001B120(6.04)9(7.50)4(3.33)5(4.17)5(4.17)CRF01_AE685(34.49)18(2.63)8(1.17)4(0.58)7(1.02)CRF07_BC759(38.22)20(2.64)15(1.98)1(0.13)4(0.53)CRF55_01B291(14.65)19(6.53)0(0.00)3(1.03)16(5.50)其他131(6.60)0(0.00)0(0.00)0(0.00)0(0.00)确证年份-0.861-0.722-0.713-0.711200854(2.72)2(3.70)2(3.70)1(1.85)1(1.85)200988(4.43)2(2.27)2(2.27)0(0.00)0(0.00)2010123(6.19)5(4.07)1(0.81)1(0.81)3(2.44)2011180(9.06)4(2.22)1(0.56)2(1.11)2(1.11)2012281(14.15)10(3.56)3(1.07)2(0.71)5(1.78)2013317(15.96)12(3.79)5(1.58)2(0.63)8(2.52)2014435(21.90)18(4.14)7(1.61)4(0.92)7(1.61)2015508(25.58)13(2.56)6(1.18)1(0.20)6(1.18)合计198666(3.32)27(1.36)13(0.65)32(1.61)26 广东药科大学硕士研究生毕业论文2.3.3耐药毒株突变情况本次研究样本序列中共有23个位点存在耐药突变，PIs突变中，Q58E位点突变发生率最高（0.6%），其次为M46I/L（0.4%）；B亚型的L90M位点突变发生率高于其他亚型（P=0.004）；CRF07_BC亚型的Q58E位点突变发生率高于其他亚型（P=0.002）；。NRTIs突变中，T215E/S位点突变发生率最高（0.45%），其次为M41L（0.15%）；B亚型的M41L和T215E/S位点突变发生率高于其他亚型（M41L：P=0.007；T215E/S：P=0.000）；CRF55_01B亚型的L210W位点突变发生率高于其他亚型（P=0.037）。NNRTIs突变中，V179D/E的发生率最高（17.82%），其次为E138G/K（0.91%）；B亚型的Y188L位点突变发生率高于其他亚型（P=0.004）；CRF55_01B亚型的A98G、E138G/K和V179D/E位点突变发生率高于其他亚型（A98G：P=0.037；2E138G/K：P＜0.001；V179D/E：χ=1580.491，P＜0.001）。详见表2-3。27 广东药科大学硕士研究生毕业论文表2-3未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者中耐药毒株的突变情况基因亚型2突变位点χPBCRF01_AECRF07_BCRF55_01BOthers合计PIs突变L10F1(0.83)1(0.15)0(0.00)0(0.00)0(0.00)2(0.10)-0.116K20T0(0.00)2(0.29)1(0.13)0(0.00)0(0.00)3(0.15)-0.489L33F0(0.00)4(0.58)0(0.00)0(0.00)0(0.00)4(0.20)-0.081M46I/L1(0.83)5(0.73)2(0.26)0(0.00)0(0.00)8(0.40)-0.323Q58E0(0.00)0(0.00)12(1.58)0(0.00)0(0.00)12(0.60)-0.002L89T0(0.00)0(0.00)1(0.13)0(0.00)0(0.00)1(0.05)-1.000L90M2(1.67)0(0.00)0(0.00)0(0.00)0(0.00)2(0.10)-0.004NRTIs突变M41L2(1.67)1(0.15)0(0.00)0(0.00)0(0.00)3(0.15)-0.007T69del1(0.83)0(0.00)0(0.00)0(0.00)0(0.00)1(0.05)-0.060F77L0(0.00)0(0.00)1(0.13)0(0.00)0(0.00)1(0.05)-1.000M184V0(0.00)0(0.00)1(0.13)1(0.34)0(0.00)2(0.10)-0.736L210W0(0.00)0(0.00)0(0.00)2(0.69)0(0.00)2(0.10)-0.037T215E/S4(3.33)3(0.44)0(0.00)2(0.69)0(0.00)9(0.45)-＜0.001NNRTIs突变A98G0(0.00)0(0.00)0(0.00)2(0.69)0(0.00)2(0.10)-0.037K101E1(0.83)1(0.15)0(0.00)0(0.00)0(0.00)2(0.10)-0.116K103N1(0.83)0(0.00)0(0.00)0(0.00)0(0.00)1(0.05)-0.060V106M0(0.00)1(0.15)0(0.00)0(0.00)0(0.00)1(0.05)-0.618V108I0(0.00)4(0.58)0(0.00)1(0.34)0(0.00)5(0.25)-0.175E138G/K1(0.83)0(0.00)4(0.53)13(4.47)0(0.00)18(0.91)-＜0.001V179D/E15(12.50)23(3.36)16(2.11)291(100.00)9(6.87)354(17.82)1580.491＜0.001Y181C1(0.83)1(0.15)0(0.00)0(0.00)0(0.00)2(0.10)-0.116Y188L2(1.67)0(0.00)0(0.00)0(0.00)0(0.00)2(0.10)-0.004G190S0(0.00)1(0.15)0(0.00)0(0.00)0(0.00)1(0.05)-0.618合计12068575929113119862注：括号外数据为发生突变的病例数，括号内为突变发生率；χ为“-”对应的P值为确切概率。28 广东药科大学硕士研究生毕业论文2.3.4基因亚型与抗病毒药物之间的关系未接受抗病毒治疗的1986份样本人群中HIV-1基因亚型主要为CRF07_BC和CRF01_AE，所占比率分别为38.22%和34.49%；其次为CRF55_01B和B亚型，分别占14.65%和6.04%；其他亚型占6.60%，包括CRF59_01B44例，独特重组型（URFs）74例，A1、C、F1、CRF08_BC、CRF54_01B各1例，CRF67_01B6例和CRF68_01B2例。详见表2-2。所有亚型中B亚型总耐药率最高，所占比率为7.50%；其次为CRF55_01B亚型，所占比率为6.53%。其中B亚型对D4T、EFV和NVP三种药物的耐药率最高，均为4.17%；其次是NFV、AZT和RPV，均为3.33%。CRF55_01B对EFV和NVP两种药物的耐药率最高，均为5.50%；其次是ETR和RPV，均为5.15%。其他亚型对各药物的耐药率均较低。详见表2-2、表2-4和表2-5。表2-4同一基因亚型对三类药物耐药率的比较2病毒亚型药物种类样本总数耐药样本数耐药率（%）χPPIs12043.33NRTIs12054.17-1.000BNNRTIs12054.17三类药物12097.50PIs68581.17NRTIs68540.581.3810.501CRF01_AENNRTIs68571.02三类药物685182.63PIs759151.98NRTIs75910.1316.444＜0.001CRF07_BCNNRTIs75940.53三类药物759202.64PIs29100.00NRTIs29131.0323.399＜0.001CRF55_01BNNRTIs291165.50三类药物291196.5329 广东药科大学硕士研究生毕业论文表2-5基因亚型与抗病毒药物之间的关系基因亚型合计药物BCRF01_AECRF07_BCCRF55_01BOthers（N=1986）（n=120）（n=685）（n=759）（n=291）（n=131）PIsATVr2（1.67）0（0.00）0（0.00）0（0.00）0（0.00）2（0.10）DRVr0（0.00）0（0.00）0（0.00）0（0.00）0（0.00）0（0.00）FPVr3（2.50）1（0.15）0（0.00）0（0.00）0（0.00）4（0.20）IDVr2（1.67）0（0.00）0（0.00）0（0.00）0（0.00）2（0.10）LPVr2（1.67）0（0.00）0（0.00）0（0.00）0（0.00）2（0.10）NFV4（3.33）8（1.17）3（0.40）0（0.00）0（0.00）15（0.76）SQVr2（1.67）0（0.00）0（0.00）0（0.00）0（0.00）2（0.10）TPVr0（0.00）0（0.00）12（1.58）0（0.00）0（0.00）12（0.60）NRTIsABC3（2.50）0（0.00）1（0.13）1（0.34）0（0.00）5（0.25）AZT4（3.33）4（0.58）0（0.00）2（0.69）0（0.00）10（0.50）D4T5（4.17）4（0.58）0（0.00）2（0.69）0（0.00）11（0.55）DDI3（2.50）0（0.00）0（0.00）0（0.00）0（0.00）3（0.15）FTC1（0.83）0（0.00）1（0.13）1（0.34）0（0.00）3（0.15）3TC1（0.83）0（0.00）1（0.13）1（0.34）0（0.00）3（0.15）TDF3（2.50）0（0.00）0（0.00）0（0.00）0（0.00）3（0.15）NNRTIsEFV5（4.17）3（0.44）0（0.00）16（5.50）0（0.00）24（1.21）ETR2（1.67）1（0.15）0（0.00）15（5.15）0（0.00）18（0.91）NVP5（4.17）7（1.02）0（0.00）16（5.50）0（0.00）28（1.41）RPV4（3.33）2（0.29）4（0.53）15（5.15）0（0.00）25（1.26）注：括号外数据为耐药病例数，括号内为耐药率。30 广东药科大学硕士研究生毕业论文2.4讨论2.4.1总体耐药率分析本次研究结果显示，2008~2015年在广州市新确证且尚未接受抗病毒治疗的MSM者中HIV-1感染者总耐药率为3.32%，尚处于世界卫生组织规定的HIV-1[42]耐药警戒线（＜5%）以下，且不同年份样本人群的总耐药率和对各类药物的耐药率均无随年份增长的趋势，表明现有药物对广州市MSM者中HIV-1感染者在总体上仍是有效的。2.4.2基因亚型与耐药毒株之间的关系已有研究均表明HIV-1基因亚型与耐药突变位点以及耐药率有一定的关联[35]。本研究发现广州市MSM者中B亚型和CRF55_01B亚型耐药率高于其他亚型，分别达到7.50%和6.53%，尤其是我国一线方案中EFV和NVP，需要引起[16]特别关注。以往研究显示，B亚型在广州市MSM者中开始流行时间较早，[36]CRF55_01B是近年来在我国MSM者的HIV-1感染者中新发现的重组亚型，[37]系统进化分析推断其重组起源于2000年左右。一些研究表明，不同亚型间耐[38-41]药率的差异可能与密码子使用差异有关，因此本研究中基因亚型间耐药率的差异是耐药突变发生率差异的反映。2.4.3突变位点与耐药毒株之间的关系[31]对照2009年WHO公布的SDRMs列表，进一步对耐药毒株的突变位点进行分析，发现本次研究总体上SDRMs发生率处于较低水平。跟据斯坦福大学耐药数据库（HIVdb）比对结果显示，在所有亚型中，B亚型的突变率最高，尤其是B亚型中的L90M、M41L、T215E/S和Y188L。CRF55_01B亚型E138G/K的发生率在所有亚型中最高。在以上描述的突变中，L90M可降低除TPV和DRV以外的每种PIs的易感性。M41L是一个TAM突变，常伴有T215Y。M41L加T215Y的组合可引起对AZT和d4T的中或高水平耐药，以及降低ddI、ABC和TDF的敏感性。T215E/S是T215Y/F的回复突变体，提示曾经存在可引起多种NRTIs耐药的T215Y/F。Y188L对NVP、EFV和RPV具有高水平耐药，对ETR具有潜在低水平耐药。E138G常发生在接受ETR和RPV治疗的患者中，偶尔发生在接受NVP和EFV的患者中，其可降低每种NNRTIs敏感性2~3倍。E138K多见于接受RPV的患者中，它使RPV敏感性降低2~3倍。31 广东药科大学硕士研究生毕业论文所有突变中，V179D/E的发生率最高，在全部样本人群中达到了17.82%，[42]殷玥琪等在2017年Meta分析报道的基于B亚型、CRF01_AE亚型和CRF07_BC亚型的V179D/E发生率为11.06％（6.24～17.00），本研究基于这三个亚型的V179D/E总体发生率为3.45%，且B亚型、CRF01_AE亚型和CRF07_BC亚型V179D/E发生率分别为12.50%、3.36%和2.11%，均低于以往报道报道，而本研究V179D/E突变发生率较高是因CRF55_01B亚型全部存在V179D/E所致。其他地区和人群流行的CRF55_01B亚型是否也具有这一特点目前尚无研究证明。有研究证明V179D/E并不能直接引起毒株耐药，但它能导致NNRTIs类药[43]物敏感性下降，从而缩短毒株的“耐药路径”，增加NNRTIs耐药发生的风险。32 广东药科大学硕士研究生毕业论文第三章小结3.1本研究的主要结论1.2008~2015年广州市MSM者中HIV-1基因亚型分布表现为CRF07_BC和CRF01_AE为主且多种亚型并存的特点。其中URFs亚型所占比率呈逐年上升趋势，提示HIV-1在MSM者中发生过不断重组，应针对多性伴者和流动人口加强干预。2.本次研究结果显示2008~2015年广州市MSM者中未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者的总耐药率为3.32%，尚处于较低水平，但B亚型和CRF55_01B亚型耐药率相对较高，值得引起关注。3.2本研究创新之处本次实验是目前针对广州市MSM者中HIV-1感染者的基因亚型和耐药性样本量最大和时间跨度最长的研究。对2008~2015年广州市地区且现住址为广州市的MSM者中HIV-1感染者的基因亚型和耐药情况做综合分析，为广州市有关MSM者中HIV-1感染者的预防控制和临床用药提供科学参考。3.3本研究不足之处由于本次研究使用HIV-1pol区基因片段进行亚型分析，而不是全长基因，使得重组亚型尤其是URFs的构成比可能比实际水平偏低。同时由于在没有药物[44,45]选择压力的环境下，适应性代价高的耐药毒株会逐渐转变回野生毒株，本次研究所选样本人群既有近期感染者也有长期感染者，因此本次研究的耐药率可能比实际水平偏低。33 广东药科大学硕士研究生毕业论文34 广东药科大学硕士研究生毕业论文参考文献[1]UNAIDS/WHOWorkingGrouponGlobalHIV/AIDSandSTISurveillance.UNAIDS/WHOglobalAIDSstatistics.[J].AidsCare,2017,10.[2]2017年12月全国艾滋病性病疫情[J].中国艾滋病性病,2018(02):111.[3]2016年12月全国艾滋病性病疫情[J].中国艾滋病性病,2017,23(02):93.[4]LuX,KangX,ChenS,etal.HIV-1GeneticDiversityandTransmittedDrugResistanceAmongRecentlyInfectedIndividualsatMenWhoHaveSexwithMenSentinelSurveillancePointsinHebeiProvince,China[J].AidsResearch&HumanRetroviruses,2015,31(10):1038.[5]HemelaarJ.TheoriginanddiversityoftheHIV-1pandemic[J].TrendsinMolecularMedicine,2012,18(3):182-92.[6]RousseauCM,LearnGH,BhattacharyaT,etal.ExtensiveIntrasubtypeRecombinationinSouthAfricanHumanImmunodeficiencyVirusType1SubtypeCInfections[J].JournalofVirology,2007,81(9):4492-4500.[7]KorberB,GaschenB,YusimK,etal.EvolutionaryandimmunologicalimplicationsofcontemporaryHIV-1variation[J].BritishMedicalBulletin,2001,58(1):19.[8]TeeKK,PonCK,KamarulzamanA,etal.EmergenceofHIV-1CRF01_AE/BuniquerecombinantformsinKualaLumpur,Malaysia.[J].Aids,2005,19(2):119-126.[9]YangR,XiaX,KusagawaS,etal.On-goinggenerationofmultipleformsofHIV-1intersubtyperecombinantsintheYunnanProvinceofChina[J].Aids,2002,16(10):1401-1407.[10]DelgadoE,AmpofoWK,SierraM,etal.HighprevalenceofuniquerecombinantformsofHIV-1inGhana:molecularepidemiologyfromanantiretroviralresistancestudy.[J].JournalofAcquiredImmuneDeficiencySyndromes,2008,48(5):599-606.[11]汪宁,钟平.中国HIV分子流行病学30年[J].中华流行病学杂志,2015,36(6):541-546.[12]童翾.我国部分地区HIV-1传播耐药分析及深度测序对继发性耐药的研究[D].北京协和医学院,2014.[13]王璐,秦倩倩,丁正伟,等.2010年中国艾滋病疫情网络直报现状与分析[J].中国艾滋病性病,2011(3):275-278.35 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广东药科大学硕士研究生毕业论文第四章综述HIV-1基因亚型和耐药性的研究现状艾滋病（Acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS），是由艾滋病病毒（Humanimmunodeficiencyvirus,HIV）感染引起的一种乙类烈性传染性疾病。自1981年全球首例艾滋病患者在美国发现并报道以来，艾滋病如今已蔓延至全球。2016年联合国艾滋病规划署（UNAIDS）最新数据显示，截止到2016年底，全球约有3670（3400~3980）万例HIV感染者/AIDS病人（PeoplelivingwithHIV/AIDS,PLWHA），2016年新发感染者约210万例。我国1985年发现国内第一例艾滋病感染者，1998年官方首次报道我国HIV-1感染者总数达到10676例，截至到2017年底，我国累计报告现存活PLWHA约75.9万例，其中2017年新[1]发感染者约13.4万例，比2016年增加9957例。4.1HIV-1病毒基本结构HIV是单链RNA病毒，需要依靠逆转录酶进行复制，由于逆转录酶缺乏核苷酸序列矫正功能，使病毒在复制过程中很容易发生突变，几乎每个碱基每个周－5期可发生3.4×10次突变，因此感染者每天可产生几百万个变异病毒，每个病5毒每10小时可产生10个病毒拷贝，是目前所知世界上重组率最高的有机生物之一。据血清学反应和病毒遗传学特征，HIV可分为HIV-1和HIV-2两种类型，HIV-1可以又可分为M组(Maingroup)、N组(Otliner)组和O组(non-Mnon-N)，其中M组致病力最强，流行也最广，占全球HIV-1流行株的约95%以上。M组包括9种亚型（A、B、C、D、F、G、H、J和K）和61种流行重组（Circulatingrecombinantform,CRF）。HIV-1全基因组长约9.8kb，由3个结构基因(gag、pol、[2]env)和6个调节基因（tat、nef、vif、vpr、vpx和rev)组成，如图1为HIV-1基因组结构及对应的HXB2位置的示意图。HIV-1的三个结构基因中pol全长约3.0kb，其与gag部分重叠，是HIV-1进行反转录复制中最保守的片段，病毒复制所必须的逆转录酶（Reversetranscriptase,RT）、蛋白酶和整合酶主要在该片段进行编码，因此pol区常被作为抗病毒药物作用的靶部位，同时也是基因耐药性分析的目的片段（PR-RT区段）。39 广东药科大学硕士研究生毕业论文图1HIV-1的基因组结构及对应的HXB2位置示意图4.2HIV-1基因分型我国目前流行的HIV-1毒株亚型种类较多，主要流行亚型有B、CRF01_AE、[3]CRF07_BC和CRF08_BC，并倾向以重组毒株为主，且不同传播途径感染人群毒株亚型分布也有明显差异，血液传播人群以B亚型为主，性传播人群以AE亚[4-8]型为主。已有研究结果显示，截止到2015年，我国性传播人群的HIV-1基因[9]亚型流行趋势是B亚型呈下降趋势，CRF01_AE和CRF07_BC呈上升趋势。[10]自2004年以来，我国HIV-1感染者中MSM者所占比率明显增加，所有结果都显示CRF01_AE亚型是我国目前HIV-1流行的优势毒株。了解HIV-1基因亚型的分布情况与流行趋势，不仅有助于追踪HIV-1传染源和提前制定预防控制措施，其在病因学研究、耐药性分析、抗病毒药物治疗及疫苗研制等方面都具有重要作用。4.3HIV-1抗病毒治疗和耐药1996年第十一届艾滋病大会首次提出对艾滋病患者使用高效联合抗病毒治疗（Highactiveanti-retroviraltherapy,HAART），实践证明HAART显著降低了艾滋病患者的发病率和死亡率，提高了患者的生存质量，并降低了艾滋病传染性[11-14]，解除了艾滋病发现就是死亡的“魔咒”。HAART是无疑目前世界卫生组织（Worldhealthorganization,WHO）、联合国艾滋病规划署（UnitednationsprogramonHIV/AIDS,UNAIDS）和国际非政府组织（Internationalnon-governmentalorganizations,NGOs）带头开展的最伟大的公共卫生行动之一。我国于2003年启动“四免一关怀”艾滋病防治政策，并在此政策的指导下于同年2003年开始全国范围的HAART大规模免费治疗，经过十多年努力，2017年我国已经建立3000多个免费抗病毒治疗门诊点，抗病毒治疗覆盖面达到70%以上，累计治疗成年AIDS病人高达约36万例。但是由于HIV易整合入患者的遗传物质内并进入潜伏状态，因此抗病毒药物并不能完全清除患者体内的病毒，并且在长期服药的过程中，由于患者依从性、HIV遗传物质的高40 广东药科大学硕士研究生毕业论文度变异性和药物相互作用的原因，HIV很容易出现耐药毒株。HIV耐药是目前抗病毒治疗面临的主要障碍之一。目前我国用于艾滋病治疗的抗病毒药物主要有蛋白酶抑制剂（PIs）、核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）和非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs）三大类，HAART是将这三类药物中的两种或三种组合使用，以达到抗病毒治疗的效果。实践证明，这种多种药物联合使用的方式确实对艾滋病病毒达到了很好的抑制作用，但是与使用单一抗病毒治疗原理一样，HAART的长期使用也会产生耐药，甚至出现针对两类或者三类抗病毒药物的双重或多重耐药，很大程度上限制了抗病毒治疗的[15-18]应答，2012年WHO发布的HIV耐药报告将HIV耐药分为两种类型：传播耐药（Transmitteddrugresistance，PDR）也称原发耐药和获得耐药（Acquireddrugresistance,ADR）也称继发耐药。TDR是指患者所感染的病毒株本身就具有耐药性。ADR是指感染者在接受抗病毒治疗过程中体内病毒株在药物选择压力下表[19]现出的耐药性。具有耐药性的病毒株会直接影响一线抗病毒药物的疗效，目前我国用于免费抗病毒的两线药物只有9种，面对有限的药物和不断扩大的抗病毒药物治疗范围以及人群，耐药毒株的传播成为抗病毒治疗顺利开展的最大障碍之[17]一。在我国，虽然发现艾滋病发现较早，但开始干预和大规模用药时间较晚，并且在开始抗病毒治疗时，由于各地医疗水平和条件不同，患者依从性不同，全国[21,22]各地观察到的原发性耐药率也有很大差异，从2.7%到25.6%不等。但是针[22]对不同流行毒株和传播途径对耐药率的影响程度还需要进一步的探讨。4.4HIV耐药目前流行情况自HAART于20世纪90年代中期在全球各地区开展以来，先开展抗病毒治疗的发达国家最先发现HIV耐药毒株，此后几年耐药毒株的流行率持续升高。[21-23]随后发展中国家开始开展HAART，也陆续出现耐药毒株。由于地区医疗水平差异，HIV毒株耐药率在全球各地分布存在明显差异，整体表现趋势为发达地区耐药率较高，但是趋于稳定；欠发达地区耐药率较低，但是呈现出明显的增长趋势。例如西欧和北美地区耐药率一直较高，尤其是MSM者，分别达到11.0%和13.7%；一项包括亚洲和美洲低收入国家的调查发现，这些地区2009~2013年[28]相比于2004~2008年耐药水平大致翻了一倍。这种现象是由于发达地区开展抗病毒治疗较早，耐药株出现较早，经过长时间的积累，因此耐药率处于较高水平，但是发达地区的医疗水平也相对较高，对病毒株耐药监测与控制有一定的技术水平；而欠发达地区由于抗病毒治疗开始时间较晚，且整体医疗水平不高，因41 广东药科大学硕士研究生毕业论文此耐药毒株近几年正是处于上升时期。有结果显示，截至2015年底，全球HIV[24]耐药率约为10.1%，其中PIs、NRTIs和NNRTIs分别为2.8%、4.0%和4.5%。我国在2003年开始实施免费抗病毒治疗时就在HIV-1感染者中发现了HIV-1耐药毒株。2009~2010年对我国HIV-1流行最严重的云南、广西和河南3省1746例未接受抗病毒治疗的感HIV-1感染者进行耐药性调查发现，该人群HIV-1的总耐药率为7.1%(95%CI:5.7%~8.7%)，针对PIs、NRTIs和NNRTIs三[29]类药物的耐药率分别为1.1%、4.4%和4.9%。由此可以看出我国在抗病毒治疗前期PIs类药物耐药率相对较低。2011年，对我国来自5个省市自治区的627名未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者，使用WHO耐药监测指南标准进行耐药结果[30]监测发现，该人群的总耐药率为2.7%，其中MSM者的耐药率达到4.3%，虽然都低于5%的耐药警戒线，但是MSM者耐药率明显偏高。无论发达国家还是发展中国家，逆转录酶相关耐药突变位点却近乎一致，例如常见的：T215F/Y/I/S/C/D/E/V/N、M41L、D67N/G/E、219Q/E/N/R、K103N/S和G190A/S，其中以NRTIs类位点的T215和NNRTIs类位点的K103N比较多见；[31]PIs类药物相关耐药突变位点主要有I85V、M46I/L和L90M。4.5小结综上所述，HIV-1高度变异的遗传特征导致了毒株多样性和复杂性的同时存在，不同传播途径的差异性使得HIV-1基因亚型在人群和地理分布上也呈现出一定的差异。艾滋病病毒亚型种类较多和耐药性的产生是目前艾滋病无法被攻克的主要原因之一，因为不同亚型毒株的生物学特征差异性导致不同毒株的敏感性、致病性和药物敏感性等方面存在差异，持续产生的耐药毒株是有限的抗病毒药物时刻面临着“无药可救”的威胁。随着科学技术的发展，HIV-1基因亚型的获取方式更加便捷，成功获取某地区特定人群中HIV-1基因亚型的分布特征与流行趋势，可以提示当地艾滋病的疫情；了解流行毒株的种类、来源、分布特征以及变异趋势，可以从分子水平上进一步分析HIV-1的传播途径、进化规律以及不同毒株的致病性和耐药突变情况；了解病毒亚型和耐药性产生的流行趋势和相互关联，可以为艾滋病流行趋势的预测和临床药物的使用策略提供科学实际的指导。42 广东药科大学硕士研究生毕业论文参考文献[1]NCAIDS,NCSTD.2017年12月全国艾滋病性病疫情[J].中国艾滋病性病,2018(1).[2]TK,B.,B.TFandC.LK,NumberingPositionsinHIVRelativetoHXB2CG.HumanRetrovirusesandAIDS,1998.[3]LiL,SunG,LiangS,etal.DifferentDistributionofHIV-1SubtypeandDrugResistanceWereFoundamongTreatmentNaïveIndividualsinHenan,Guangxi,andYunnanProvinceofChina[J].PlosOne,2013,8(10):e75777.[4]苏迎盈,刘慧鑫,吴静,等.中国HIV-1基因亚型分布及流行趋势[J].中华流行病学杂志,2014,35(10):1164-1168.[5]汪宁,钟平.中国HIV分子流行病学30年[J].中华流行病学杂志,2015,36(6):541-546.DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.06.001.[6]邵一鸣,苏玲.全国范围艾滋病毒分子流行病学研究[J].医学研究杂志,2000(11):19-20.[7]HeX,XingH,RuanY,etal.AcomprehensivemappingofHIV-1genotypesinvariousriskgroupsandregionsacrossChinabasedonanationwidemolecularepidemiologicsurvey[J].PlosOne,2012,7(10):e47289.[8]金艳涛,郭会军,姜枫,等.中国HIV-1基因亚型分布文献分析[J].卫生研究,2011,40(5):645-648.[9]YuanR,ChengH,ChenLS,etal.PrevalenceofdifferentHIV-1subtypesinsexualtransmissioninChina:asystematicreviewandmeta-analysis[J].Epidemiology&Infection,2016,144(10):2144-2153.[10]UNAIDS,GLOBALAIDS.2016.[11]ValdiserriRO.ThirtyyearsofAIDSinAmerica:Astoryofinfinitehope[J].AidsEducation&PreventionOfficialPublicationoftheInternationalSocietyforAidsEducation,2011,23(6):479-94.[12]JaggyC,vonOverbeckJ,LedergerberBetal.MortalityintheSwissHIVCohortStudy(SHCS)andtheSwissgeneralpopulation[J].Lancet.2003,362(9387):877–878.DOI:10.1016/S0140-6736(03)14307-3.[13]PalellaFJ,Jr.,DelaneyKM,MoormanACetal.Decliningmorbidityandmortalityamongpatientswithadvancedhumanimmunodeficiencyvirusinfection.HIVOutpatientStudyInvestigators[J].NEnglJMed,1998,338(13):853–860.DOI:10.1056/NEJM199803263381301.43 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广东药科大学硕士研究生毕业论文附录中英文缩写对照AIDSAcquiredimmunodeficiencysyndrome获得性免疫缺陷综合症HIV-1Humanimmunodeficiencyvirustype1人类免疫缺陷病毒Ⅰ型HAARTHighlyactiveantiretroviraltherapy高效抗逆转录病毒治疗NNRTIsNon-nucleosidereversetranscriptioninhibitors非核苷类逆转录酶抑制剂NRTIsNucleosidereversetranscriptioninhibitors核苷类逆转录酶抑制剂PIsProteaseinhibitors蛋白酶抑制剂DRMDrugresistancemutations耐药突变位点AZTzidovudine齐多夫定D4Tstavudine司他夫定EFVefavirenz依非韦伦FTCemtricitabine恩曲他滨NVPnevirapine奈韦拉平TDFtenofovir替诺福韦3TClamivudine拉米夫定PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应RT-PCRreversetranscriptasepolymerasechainreaction反转录聚合酶链反应RNAribonucleicregion核糖核酸Polpolymeraseregion聚合酶区WHOWorldHealthOrganization世界卫生组织CDCCenterfordiseasepreventionandcontrol疾病预防控制中心103N基因表达方式，以“位置-字母”方式书写，数字“103”表示氨基酸残基在蛋白质中的位置，字母“N”表示发生突变后替换的氨基酸残基。46 广东药科大学硕士研究生毕业论文致谢时光荏苒，光影似箭，曾经觉得遥不可及的三年时光，转眼已将是往日。回首三年，有过迷茫与彷徨，也有过坚定与喜悦，更多留下的是成长与感激，感谢这一路走来关心、支持、鼓励和帮助过我的人。感谢母校广东药科大学，感谢广东药科大学公共卫生学院的每一位老师，因为你们的努力与付出，才有我们这次学习的机会与平台。感谢导师夏云老师，夏老师不仅在学业上给予我悉心的教导和不懈的支持，在思想和生活上也给予我无微不至的关怀。感谢校外导师韩志刚老师，在课题完成过程中，韩老师以师者的智慧和学者的严谨，给予我很多指导与帮助。感谢广州市疾病预防控制中心艾滋病预防控制部的徐慧芳、蔡衍珊、陈希、高凯、黎庆梅和吴昊等一群可敬可爱的老师们，有幸跟随你们学习，我受益匪浅，你们对工作的热情和对生活的热爱是我毕生学习的榜样。感谢刁书琴师姐、孙盼盼师姐、靳伟师兄、马彩娟师姐和殷俊学长这三年来的热情帮助。感谢家人和朋友一直以来的支持、信任与陪伴！感谢广州市科技计划项目（201707010184，201704020219），因为该项目的全力支持，本次课题才能顺利完成。最后，再次感谢所有关心、支持、鼓励和帮助过我的人，希望你们身体健康，一切顺利！硕士期间发表论文[1]张亚丽,韩志刚,吴昊,夏云.应用FastTree2.1.8快速构建HIV-1pol区基因的最大似然系统进化树[J].中国艾滋病性病,2017(8):695-699.[2]韩志刚,张亚丽,吴昊,程伟彬,梁彩云,钟斐,高凯,徐慧芳.广州市2008-2015年男男性行为人群HIV-1亚型分布特征及变化趋势[J].中华流行病学杂志,2018,39(1):67-71.47 广东药科大学硕士研究生毕业论文48