抗菌肽thanatin基因载体构建和表达及提高植物对菌核病抗性的研究

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1、中文摘要抗菌肽是生物体防御系统产生的一类对外源病菌具有高效杀灭活性的小分子多肽，在植物抗病基因工程中具有重要的应用价值。Thanatin是刺肩蝽(PodisusmacuLiventris)成虫经诱导产生的一种抗菌肽，由21个氨基酸残基组成，该抗菌肽对细菌以及真菌都有很强的抗菌活性，本研究通过转基因技术将其转入模式植物拟南芥和油菜，以提高植物的抗病性尤其是对菌核病的抗性。1Thanatin的融合植物表达载体的构建根据GenBank登录的Thanatin／芋列设计引物，分剐合成前端含信号肽和连接肽的基因片段，即sPmallatin和LP-Thanatin，分别克隆到

2、pMDl8．T载体上。通过SP．Thanatin3’端设计了BglⅡ切点，LP．Thanatin5’设计了BamⅢ切点，利用Bglll幕1]BamHI为同尾酶的特点，LP-ThanatinBglIFBamHI双酶切片断可多轮次替换SP-Thanatin上的终止密码子(TAG)构建成可剪切多拷贝抗菌肽融合植物表达载体。结果鉴定1—5拷贝的Thanatin融合植物表达载体构建成功。2转基因油菜和拟南芥的获得通过农杆菌介导和Inplanta技术将卜5拷贝的Thanatin融合植物表达载体分别转化油菜和拟南芥，由于转油菜的周期长和效率低，目前我们只获得5拷贝的To代转基

3、因油菜，而获得了卜5拷贝的全部转基因To代拟南芥，对转基因油菜和拟南芥进行菌核病抗性鉴定，结果显示转基因植株中并无预期中的高抗菌核病类型。3Ihanatin的亚细胞定位和原核表达构建SP—Thanatin．GFP融合基因，利用基因枪轰击洋葱表皮。洋葱表皮细胞瞬时表达融合蛋白，在荧光显微镜下观察显示荧光蛋白特异性地定位于细胞间隙，表明信号肽能成功的将目的蛋白引导到细胞外。同时构建Thanatin的原核表达载体pGEX—Thanatin，诱导表达后经12％SDS．PAGE分析，显示在约36KD处有特异性条带，证明Thanatin能在大肠杆菌中表达且效果良好。关键词：

4、菌核病；甘蓝型油菜；拟南芥；转基因；Thanatin基因；原核表达AbstractAntimicrobialpeptideisasmallpeptidewithhighantimicrobialactivityagainstexteriorpathogencomingformrecoverysystemoforganism．Itplaya11importantroleintheprojectOfplantdiseaseresistanceimprovement．Thanatin，a21-residuepeptide，isaninducibleinsectpept

5、idewithabroadrangeofantimicrobialactivityagainstbacteriaandfungi．InthisstudythegenehasbeenusedtotransformplantstoimprovediseaseresistanceespeciallytoSclerotiniascolerotiorum．1ConstructionofThanatinfusionvectorsforplantexpressionBaseonthesequenceinGenBank．weconstructthegeneswitll5’fus

6、ionsignalpeptideorlinkpeptide，andthentheywereclonedinpMDl8-Tvector．SP—ThanatincontainedaglIIin3’andLP—ThanatincontainedBamHIin5’BglIIandBamHIhavethesamesequenceofadhansiveend，SOtheCO-adhansiveendrestrictionandligationstrategyWasusedaddtherepeatunitonebyone，PCRamplificationandDNAseque

7、ncinganalysisconfirmedthat1-5copiesofthegenewerecorrectlyinsertedintothevector．2TransformationofoilseedrapeandArabidopsisthalianaThelusedvectorofThanatinWasincorporatedintoBrassicanapusandArabidopsisthalianaviaAgrobacterium-mediatedtransformation，forlongperiodandlowefficiencyofoilsee

8、drapetransfo