拟穴青蟹微卫星标记开发及应用研究

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1、上海海洋大学硕士学位论文拟穴青蟹微卫星标记开发及应用研究姓名：崔海玉申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：马凌波20110617上海海洋大学硕士学位论文拟穴青蟹微卫星标记开发及应用研究摘要拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)隶属于甲壳纲(Cmstacea)、十足日(Oecapoda)、短尾亚目(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidac)、青蟹属(Scylla)，广泛分布于印度．西太平洋沿岸水域，在我国主要分布于东南沿海水域。近年来拟穴青蟹养殖规模不断扩大，对拟穴青蟹苗种的

2、需求量也越来越大，优良品种的选育就显得尤为重要。遗传多样性的高低是由遗传变异的多少和群体遗传结构决定的，它与物种的进化潜力和耐受不良环境的能力息息相关。因此，研究遗传多样性对于物种保护、维持生态环境平衡等具有重要的理论意义和应用价值。本研究采用5’锚定PCR技术开发拟穴青蟹微卫星标记，根据自行分离的微卫星序列获得多态性引物18对，并以中国东南沿海拟穴青蟹11个地理群体和6个家系群体为实验材料，分别对拟穴青蟹野生群体和家系群体进行遗传多样性分析。获得的实验结果如下：1、设计5’锚定引物3对，以拟穴青蟹基

3、因组DNA为模板进行扩增，然后回收片段大小在250--750bp的片段进行克隆测序。挑取单克隆247个，其中220个克隆包含插入序列，占全部克隆数的89．07％。觑144个克隆测序，其中共有112条序列在序列两端或／和中间存在串联重复序列(77．78％)。根据测得的序列利用PrimerPremier5．0软件设计引物90对，其中18对引物的扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后条带清晰可见，且表现出多态性。18个微卫星位点的观测等位基因数Ⅳa在≯9之间，平均每个位点6．9个，有效等位基因数Ⅳe在1．7~7

4、．3之间，平均每个位点4．3个；等位基因大小在166--316bp之间。观测杂合度Ho和期望杂合度HE分别在0．33～0．92和0．42～0．86之间，多态信息含量PIC在0．39-0．88之间；经Bonferroni校正后，有3个位点(Scypal3、Scypal4和Scypal5)显著偏离哈迪·温伯格平衡(P<0．0028)，这可能是由于群体数量有限或者无效等位基因的存在造成的。经MICRO．CHECKER软件计算，位点Scypal3、Scypal4和Scypal5的无效等位基因频率分别为0．24

5、、0．15和0．15；位点之间不存在连锁不平衡。这一结果表明，18个标记均具有较高的多态信息含量，用于分析拟穴青蟹群体遗传多样性研究具有一定的可靠性和可信性。上海海洋大学硕士学位论文2、利用9对微卫星引物对我国东南沿海拟穴青蟹11个地理群体397个个体进行了遗传多样性分析，9个位点在11个群体共检测至lJl04个等位基因，平均每个位点有11．6个等位基因，其中位点Scypal的Ⅳa最少(6个)，位点Scypa8和Scpa03最多(16个)；Ⅳe在2．5～11．8之间，平均每个位点5．3个；各个群体的平

6、均凰和魄分别在o．62~O．771和o．66--0．76之间。对11个群体的分子方差分析(AMOVA)结果显示，群体间的遗传分化系麴=0．0138，即总的遗传变异中有1．38％的变异来自群体间，98．62％的变异来自群体内。根据遗传距离采用UPGMA法对11个群体进行聚类分析，深圳群体和漳州群体间的遗传距离最小(O．0121)，先聚合在一起，三门群体与其它群体间的遗传距离较大。总的来说，各个群体均具有较高的遗传多样性，且平均杂合度呈现出自南向北逐渐降低的趋势，而群体间的遗传分化程度较低。这一结果为拟穴

7、青蟹种质资源的保护以及人工育种等工作提供了科学依据和资料支持。3、利用8个微卫星标记对拟穴青蟹6个家系共275个个体进行了遗传多样性分析，共检测到50个等位基因，平均每个位点4~8个，其中3个家系各自在1个位点表现为单态，8个位点的PIC、Ho和HE分别在0．40,--0．77、0．33～0．81和0．42～0．80之间。对6个家系的AMOVA分析结果显示，家系间的遗传分化系数Fsr=0．2057，即总的遗传变异中有20．57％的变异来自家系间，79．43％的变异来自家系内。根据遗传距离采用UPGMA

8、法对6个家系进行聚类分析，4号家系和5号家系之间的遗传距离最小，先聚合在一起，2号家系和6号家系间的遗传距离最大．总的来说，各个家系的平均杂合度与野生群体接近，但家系间的遗传分化程度远大于野生群体间的分化。这一结果对拟穴青蟹家系选育具有重要的指导意义，不但了解了种质资源情况，也有助于在家系选育过程中避免近交衰退、有效群体减少等不良现象的产生。系关键词拟穴青蟹，微卫星标记，5’锚定PCR，遗传多样性，野生群体，家上海海洋大学硕士学位论文Developmen