重组腺相关病毒介导人内皮抑素

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!"!#《癌症》$%&’()(*+,-’./+0$.’1(-2344323!5!36：!"!#7!"!8重组腺相关病毒介导人内皮抑素抑瘤作用的实验研究路国秋!!，吴小兵3!，张雪艳!，2查园园2杨建国付明!!，吴旻!!!2梁肖2林晨5!=中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室2北京!4443!；3=中国预防医学科学院病毒研究所病毒基因工程国家重点实验室2北京!444J36【摘要】背景与目的：研究表明，内皮抑素能抑制肿瘤血管的生成，进而抑制肿瘤的生长和转移，然而有关内皮抑素治疗的研究报道却很少。本研究初步探讨了重组腺相关病毒介导内皮抑素对肿瘤生长和转移的作用。方法：用K?9L$K方法获得人内皮抑素基因，构建内皮抑素可分泌表达的通用型重组腺相关病毒（-MMN）载体，包装获得重组腺相关病毒-MMN9OO9D’P+)I.I&’。以动物实验分析其抗肿瘤作用。结果：$J;QRS@小鼠肌肉注射!4!!?T-MM$9OO9D’P+)I.I&’一次，该重组病毒对小鼠黑色素瘤Q!@A!4移植瘤生长的抑制率为J;=!U，在实验肺转移模型中，对转移灶的抑制率为;4=;U。结论：重组腺相关病毒介导的内皮抑素能有效抑制肿瘤的生长和转移。关键词：重组腺相关病毒；内皮抑素；肿瘤；基因治疗中图分类号：K;"9"文献标识码：M文章编号：!4447#@;V（3443）!37!"!#74J!"#"$%&’()*’"+,*-./01(%2))"&*()301$,2,4(#*$*-,5"4-$*"467!"&(16-,$,*+4",(.+##(&-$*"48-%0#!!3!RTW,+9X&,2YZM[,.’9,.’2]TV&.+9H&’^2[M834?38+3.&;80%/6+//&4&5@&8A834!BBBC!5="D"6783%EC"#$%$&’&()%*+,%$+,(-+,.+/&01/%,F8,+/+4(%3;G&3&$80H3483&&,8345I39$8$1$&+-F8,+/+4(56:=.5@&8A834!BBBJC5="D"6783%【+6#*%$&*】9$&:;%(0,4<=6>"&*-?"@‘Ia.)-(G+-I(PI%.I(’P+)I.I&’1+,/P&’%&H&II,E+-.’^&+^(’()&)2I%(’&’%&H&II%(^-+aI%.’PE(I.)I.)&)+0I,E+-=Z+a(b(-2I%(-(a.)0(a-(G+-I.H+,II%(I-(.IE(’I,).^(+0(’P+)I.I&’=?%&))I,Pa.)P()&^’(PI+(BG/+-(I%((00(1I+0(’P+)I.I&’E(P&.I(Pa&I%-(1+EH&’.’I.P(’+9.))+1&.I(Pb&-,)5-MMN6+’I,E+-^-+aI%.’PE(I.)I.)&)=5"*’(4#@?++HI.&’I%((’P+)I.I&’^(’(1+EG/(I(1c>;收稿日期：344394#943:修回日期：344394893;年分离得到的一种血管生成抑制因子2对应于胶原基金项目：国家自然科学基金项目5<+=">8;48">6蛋白!"9$末端!8#个氨基酸g!h，它是一种内源性!通讯作者：?(/：8@7!47@;;3";>"A.BC8@7!47@;;3";>"血管生成抑制因子2可以特异性地作用于血管内皮D9E.&/：1/&’FG,H/&1=HI.=’(I=1’细胞，抑制内皮细胞的增殖和迁移2在动物实验中 路国秋，等$重组腺相关病毒介导人内皮抑素抑瘤作用的实验研究!"!#可以抑制多种肿瘤的生长而不产生耐药%&’。目前，内I&Y#Z1[[..[.R;RR.;R.;RR[[.[[;.[R;.R[.皮抑素在美国正在进行的!期临床试验显示了良好.[1"Z)@"Y#Z1;;[[..RR;[;;.;;.R[[.[.;1"Z。的安全性和一定的治疗效果，有着很好的应用前!"#克隆人内皮抑素基因景。但是内皮抑素常用的蛋白给药方式存在较多不采用R/:S6E试剂，提取人胎肝总I-.，逆转录为%"’足，如费用昂贵、需要每天注射等，不利于临床广+,-.，以@!I!为引物进行J;I扩增，循环参数为泛应用。基因治疗在理论上可以有效地克服上述蛋](M#X:4，](M(#7，**M!X:4，<&M!X:4，"A个白用药的缺点，选择合适的载体，实现内皮抑素的长循环。将上述J;I产物克隆入=EFG7+/:B8"2D载体期稳定表达。重组腺相关病毒载体是近年来研究较的=9XC!和C:45$位点。将酶切鉴定的阳性克隆送多的一种病毒载体，它能将目的基因整合到染色体测序（上海博亚公司），序列正确的命名为=EFG7+/:B8"上，同时只引起“低或无”的免疫反应，因而能实现目2D134567898:4。的基因的长期稳定表达%(’。因此，重组腺相关病毒!"$添加信号序列%#’载体适合用于抗血管生成疗法的基因治疗)并且已以上述阳性克隆载体的质粒为模板，以@&I&、经在细胞水平得到了肯定的结果%*’。为了探讨内皮抑@"为引物进行J;I扩增，J;I过程分为两部分。第素基因治疗的可行性，我们以人胎肝+,-.为模板，一部分&A个循环，循环参数为](M#X:4，](M(#克隆了人内皮抑素基因，并构建了可分泌表达的人7，**M!X:4，<&M!X:4，其中退火温度每一循环降内皮抑素重组腺相关病毒载体/..0122134567898:4，低A$#M，第&A循环时退火温度为#*M。第二部分研究了它对;#<=>?*小鼠黑色素瘤=!*@!A移植瘤!#个循环，退火温度稳定为#*M，其余循环参数与的形成、生长和转移的抑制作用。第一部分相同。!"%腺相关病毒质粒载体&’()*+’’+,-./01213-!材料与方法的构建!"!材料将上述添加完信号序列的内皮抑素基因克隆到实验标本胎肝来自流产正常胎儿；通用型腺相腺相关病毒载体B2-.0的3+6I!和=TE"的酶切位关病毒载体B2-.0、金黄地鼠胚胎肾细胞=CD1&!点处。和小鼠黑色素瘤细胞=!*@!A，由病毒所保存。!"4重组腺相关病毒5))*+’’+,-./01213-的包装RK=EFG7+/:B8"2D质粒、大肠杆菌,C##菌株由本室保@F[3-3*试剂的介导下，将上述B2-.01存。细胞培养条件为含!AH胎牛血清的IJKL1!*(A22134567898:4阳性重组克隆转染=CD1&!细胞，转染培养基，"?*按试剂盒说明书进行，[(!^筛选出稳定转染的小鼠，#O*周龄，雄性，本所动物室提供)动物合格=CD1&!细胞。其后的包装参照文献%]’进行。证号2PQDLL1AA1AAA#。!"65))*+’’+,-./01213-对小鼠黑色素瘤I-.提取试剂盒R/:S6EIG9TG48U:8、转染试剂7!68!9的形成及生长抑制实验RK!&只;#<=>?*雄性小鼠，随机分为两组，实验@FTG4G*以及各种限制性核酸内切酶、连接反应及J;I相关试剂分别购自>:VGRG+W46E6T:G7、I6+WG组在小鼠的左侧胫骨前肌注射&AA%E、滴度为和J/6XGT9公司。!&A$#_!AR‘aR/94715F+:4TF4:8b的重组腺相关病毒引物由上海生物工程公司合成。从人胎肝扩增/..0122134567898:4，对照组注射同体积的生理盐内皮抑素的引物为@水，两周后每鼠右前肢皮下接种!_!A*!I!，末端分别含有=9XC!位点?XE=!*@!A和C:45$位点。引物序列如下，@!Y#Z1R.[[.R;;肿瘤细胞A$!XE，接种!A天后肿瘤长出，隔天用卡尺测量其长径及短径，按公式!c9d&[.R[;.;.[;;.;;[;[.;RR;;.1"Z，I!：#Z1;;[.?&a9)d分别.[;RR[;[;R.;RR[[.[[;.[R;.R[..[;1"Z。用为最长和最短的瘤径b计算瘤体积，绘制肿瘤的生长来添加信号序列的引物为@&I&，@&含有小鼠的LTD曲线。&A天处死小鼠，剥离瘤块并分别照相。将瘤信号序列，I&为下游引物，@"序列与@&前&&个碱块称重，计算抑瘤率。抑瘤率ca!e实验组瘤重?对基相同，为提高J;I效率和特异性。引物序列如照组瘤重b_!AAH。下，@&Y#Z1;;[[..RR;[;;.;;.[[.[.;.[.;.;!":5))*+’’+,-./01213-对小鼠黑色素瘤细胞.;R;;R[;R.R[[[R.;R[;R[;R;R[[[RR;;.[[7!68!9肺转移的抑制实验RR;;.;R[[R[.;[;[[.R;;[.R[;.;.[;;.1"Z取!&只雄性;#<=>?*小鼠，随后的处理同 !"!#路国秋，等&重组腺相关病毒介导人内皮抑素抑瘤作用的实验研究上。$周后每鼠通过尾静脉注射%&’()浓度为!*0"A?445&22&@789:;<;=7对()*+,-.小鼠移植#黑色素瘤的形成及生长抑制!%+(),!#-!%肿瘤细胞悬液。接种细胞后$周处死小鼠，取出肺组织，福尔马林固定，在放大镜下计肌肉注射/55AB@@BODE29FGF0D两周后，接种肿瘤数转移结节数。同时取鼠的左侧胫骨前肌标本，液氮细胞,!#-!%，第!%天对照组有"个小鼠可以触摸中保存，以备检测内皮抑素的表达。到瘤块，而实验组则没有；第!$天实验组才有!个!"#$%&’($分析内皮抑素在()*+,-.小鼠胫小鼠有瘤块出现，而对照组则已全部出现瘤块，一直骨前肌中的表达到第!M天实验组还有两只小鼠没有触及瘤块。取注射病毒部位的肌肉组织，用./012)试剂盒绘制肿瘤生长曲线如图$所示，$%天处死小提取组织总345，逆转录后进行673扩增。鼠，剥离瘤块称重，对照组小鼠平均瘤重为>’&#=8!"/数据处理!&!R?S，治疗组为>$&M"8!&MR?S，说明/55AB@@B所有数据均采用!89表示，行"检验。ODE29FGF0D对,!#-!%移植肿瘤的形成和生长具有明显的抑制作用，肌肉注射/55AB@@BODE29FGF0D一次，0结果对肿瘤生长抑制率为’=&!T，经统计学处理差异有0"!克隆和鉴定人内皮抑素基因显著性>#U%&%!，"VM&!’?。人内皮抑素的预期长度为’’!:;。从胎肝中扩增出的<45条带电泳大小约’=%:;>两侧加有酶切位点?，与预期结果一致>图!?。<45测序结果表明，目的基因序列与已发表的基因库中的内皮抑素基因序列完全一致。图$/55AB@@BODE29FGF0D在体内实验中的抑瘤曲线-0S&$.YO0D]0]2FH(2/0DY0:0F02DXH/]O2Z/55AB@@BODE29FGF0D图!673扩增CDE29FGF0D电泳结果0")?445&22&@789:;<;=7对小鼠黑色素瘤-0S&!C)OXF/2;Y2/OF0X/O9H)F2ZODE29FGF0DG(;)0Z0OE:[673+!.B!C肺转移抑制实验!&ODE29FGF0D$&JG/O/实验组的转移灶平均为N&#=个，而对照组则为0"0信号序列的添加及腺相关病毒质粒载体$R&#=个，实验组明显少于对照组，抑制率达到12345&22&6789:;<;=7的构建=%&!T，统计学处理差异具有显著性（#U%&%’，"用673方法添加信号序列，加有信号序列的目V$&=#）。的基因为#=$:;，电泳迁移率比原基因稍慢。将该目0".?445&22&@789:;<;=7在()*+,-.小鼠胫骨的基因构建到腺相关病毒质粒载体;@45A上，酶切前肌的表达检测结果及测序表明该基因已经正确插入质粒载体。为检测重组腺相关病毒/55AB@@BODE29FGF0D感0">重组腺相关病毒?445&22&@789:;<;=7的包染小鼠后ODE29FGF0D的表达，分别提取实验组和对照装、鉴定及滴度测定组7’=,W+#小鼠胫骨前肌的总345，3.B673分析.J;@45AB@@BCDE29FGF0D经-HIC4C#介导转染ODE29FGF0D的表达如图"所示。从电泳结果可以看,KLB$!细胞后，经IM!N筛选，两周后获得稳定转到，@@BODE29FGF0D在实验组中均有表达，在对照组中染的阳性克隆CDE2B,KLB$!细胞。以具有包装功能无表达。的单纯疱疹病毒/K@A感染CDE2B,KLB$!细胞，包>讨论装出重组腺相关病毒/55AB@@BODE29FGF0DP测其滴度为%&’*!%!$实体肿瘤由两个相互作用的部分构成：肿瘤实.Q。 路国秋，等$重组腺相关病毒介导人内皮抑素抑瘤作用的实验研究!"!#源蛋白并把它们分泌到血液中去。另外，选择肌肉注射还与考虑到免疫反应有关，研究表明，其他给药途径较肌肉注射=HHVM!RO图"%&’()%分析**’+,-./0102,在)3#4567小鼠胫骨前肌的表达更易引起细胞免疫。（"）采用829$":;<=+//2.,.>**’+,-./0102,2,)3#4567?.@/+02A21B?@/CB+了较高的病毒滴度进行基因转DED1=F+=GHE!I70J+%&’()%<=.-@C0/.>7+;<+=2?+,0?2C+G4E!I70J+%&’()%<=.-@C0/.>7移。由于我们采用的是新近研究C.,0=.B?2C+成功的重组=HHV包装系统M!!O，质K肿瘤细胞L和肿瘤间质K内皮细胞、炎性细胞、纤使我们能够得到较高滴度的=HHV’**’:,-./0102,，在维细胞等L。其中间质中的血管生成对许多实体肿瘤本实验中，我们采用了!R!!&W6鼠，也有利于提高内的生长及转移起关键性作用M#，NO，肿瘤的生长依赖于皮抑素的表达水平。（X）=HHV目的基因上游含有巨新生血管为其提供养料和氧气，缺乏新生血管的情细胞病毒K)DVL的立即早期增强子和启动子，起始况下肿瘤可长期处于!IP??"的微小状态。一旦肿密码子附近含Y.Z1F序列，这些都有利于提高内皮瘤血管生成，肿瘤获得充足的营养供应后便迅速生抑素表达水平。长乃至转移；若抑制肿瘤的血管生成，则肿瘤表现为本实验表明，一次注射=HHV’**’:,-./0102,具生长抑制甚至坏死或凋亡。传统的疗法如化学治疗、有明显抑制肿瘤形成和生长的作用。对比实验组与放射治疗、生物治疗等主要针对的靶细胞是肿瘤细对照组瘤块的重量，可以看到实验组瘤重比生理盐水胞，通过对靶细胞的直接杀伤发挥作用，与此相对应对照组小得多，对肿瘤生长的抑制率达到3#$!S，的是近年发展起来的一种新的治疗策略，它以肿瘤=HHV’**’:,-./0102,对肿瘤转移的抑制作用更为显间质中的血管为靶点，此即肿瘤的抗血管生成疗著。将4!78!R细胞通过尾静脉注射建立的实验性法。小鼠肺转移模型，单次肌肉注射=HHV’**’:,-./0102,内皮抑素是近年来新发现的血管生成抑制蛋对肿瘤转移的抑制率达到了#R$#S。考虑到黑色素白，本实验研究探讨了内皮抑素在基因治疗中的应瘤恶性程度高，术后易复发转移，而且对放化疗不敏用。鉴于人内皮抑素和鼠内皮抑素序列同源性达感，因此本研究有可能为黑色素瘤的临床治疗提供QRS以上，已有的研究表明它们的功能基本一致，一个新的治疗方法。为了后续研究的方便，我们()%扩增得到了人内在实验过程中我们发现，接种![!R3个4!78!R皮抑素的CTUH全长，构建了内皮抑素的重组腺相肿瘤细胞，!R天后对照组中就有"个小鼠可以触及关病毒=HHV’**’:,-./0102,，经过体外感染包装细瘤块，而实验组则全部没有，直到第!P天实验组才胞，获得病毒经纯化可达较高的滴度（!R!P有!只小鼠有瘤块出现，而对照组此时已全部出现&W），将此重组=HHV’**’:,-./0102,预先注射到)3#4567小瘤块，到第!X天实验组还有P只)3#4567小鼠没鼠的左侧胫骨前肌，两周后待内皮抑素充分表达有长出瘤块，这表明=HHV’**’:,-./0102,导入体内后，给小鼠接种4!78!R肿瘤细胞并观察其抑瘤效后，可明显延迟肿瘤的出现。从肿瘤生长曲线上可果。以看出，=HHV’**’:,-./0102,发挥抑制作用主要发以往的研究表明，内皮抑素的治疗效果与其用生在肿瘤最初的生长阶段，待瘤块长到一定体积量有关M!O。本实验中为了提高内皮抑素基因转移效后，=HHV’**’:,-./0102,的抑制作用则不明显。因率及表达量，我们注意了以下几个方面。（!）先向小此，在将来的临床应用中，=HHV’**’:,-./0102,用于鼠注射=HHV’**’:,-./0102,，进行基因转移，两周后手术后抑制肿瘤转移和微小病灶的生长可能更为有再接种肿瘤细胞，这是因为=HHV表达目的蛋白有效。造成这种现象的原因可能与肿瘤血管生成的具自身的特点：在小鼠中，大约转染两周后，=HHV中的体过程有关：肿瘤血管的生成受各种正负因子调控，目的基因才有足量的表达，一个月后达到高峰MQO。在肿瘤形成的最初阶段由于肿瘤还不够大，因而肿（P）以小鼠的肌肉为基因转移对象也是为了提高内瘤分泌的血管刺激因子还不是很多，此时=HHV’**’皮抑素的表达水平，因为有研究表明=HHV对肌肉:,-./0102,表达的内皮抑素浓度足以与肿瘤细胞分或肝脏组织的感染效率较高，并且肌细胞的转换速泌的血管刺激因子对抗，可以对肿瘤的形成和生长度比较慢，周围血管丰富，使它非常适合用来表达外发挥抑制作用。但随着肿瘤体积的增大，肿瘤细胞及 !"!#路国秋，等$重组腺相关病毒介导人内皮抑素抑瘤作用的实验研究在它刺激下的巨噬细胞及某些间质细胞所分泌的血%)&WGJ@>4NF$/5>4619776S:98>5Z:.J794568D>.T68>48:9?Z>S86.7L6.管生成刺激因子越来越多，在肿瘤局部的浓度越来94G:67898:4945>4567898:4G>4>8D>.9T@%N&$/5Z3UTA>5C:6?B’---B(*)I()+P(**$越大，而.//0122134567898:4表达的内皮抑素浓度%*&WGJ@>4NFBJYBO?6J7>A3，>89?$/564619776S:98>55>?:Z>.@的增加并不足以与之对抗，导致.//0122134567898:46L948:94G:6G>4:SL9S86.79794948:8JE6.78.98>G@%N&$O94S>.对肿瘤抑制作用不明显。=>7B!,,#，)#I)*+"P)*++$总之，本实验研究表明，重组腺相关病毒介导%+&Q6?RE94N$2>E:49.7:4A>5:S:4>6L8D>C>8D]7.9>?^67T:89?B34567898:4的基因治疗能有效地抑制肿瘤的生长和C67864$O?:4:S9?9TT?:S98:6476L.>7>9.SD6494G:6G>4>7:7%N&$W34G?NA>5B!,,)B"""I!+)+P!+*"$转移，可能具有较好的临床应用前景。%#&C9:??:>OFB:47?>8AO，C.95?>@WN$FJE6.Z97SJ?98J.>P9T68>48:9?8D>.9T>J8:S89.G>8%N&$C.NO94S>.B!,,)，+’I’)+P%参考文献&’*+$%!&;<=>:??@A2BC6>DEFB2D:4GHB>89?$34567898:4I94>456G>46J7%,&A9?:R/_BA649D94Y3B/??>4‘a，>89?$_:4>8:S76L.>S6EK:4948:4D:K:86.6L94G:6G>4>7:79458JE6.G.6M8D%N&$O>??B!,,+B##I95>4619776S:98>5Z:.J7E>5:98>5G>4>8.947L>.%N&$N0:.6?B’---，’++P’#)$+(：")))P")*)$%’&C6>DEFBQ6?RE94NBC.6M5>.F，>89?$/48:94G:6G>4:S8D>.9T@6L%!-&C.6SR78>58‘XBY6579R6LLXABQ64Ga，>89?$]45JS8:646L>UT>.:E>489?S94S>.56>7468:45JS>9SVJ:.>55.JG.>7:7894S>%N&$:EEJ4:8@86948:G>47>UT.>77>5K@.>S6EK:494895>4619776S:98>5W98J.>B!,,+，",-I(-(P(-+$Z:.J75>T>457648D>.6J8>6L95E:4:78.98:64%N&$O?:4]EEJ46?B%"&O.@789?=X$FD>K65@979E94JL9S8J.>.6L>4567898:4%N&$W98!,,,B,’I*+P+)$C:68>SD46?B!,,,B!+I""*P""+$%!!&伍志坚，吴小兵，侯云德$系列腺病毒伴随病毒载体的构建及%(&A649D94Y3B29EJ?7R:=N$//0Z>S86.7I:7S?:4:S9?7JSS>7764表达!1半乳糖苷酶的研究%N&$病毒学报B’---，!*I!P*$8D>D6.:[64%N&$X>4>FD>.，’---B+I’(P"-$%编辑：张菊；校对：杨允贵&