脱氯酶负载碳纳米管修饰电极上二氯甲烷电生物脱氯反应的研究.pdf

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1、分类号：X703单位代码：10346密级：学号：2015111010032硕士学位论文（学术学位）中文论文题目:脱氯酶负载碳纳米管修饰电极上二氯甲烷电生物脱氯反应的研究英文论文题目:TheBioelectrocatalyticDechlorinationofDichloromethaneattheDehalogenasesonMultiwalledCarbonNanotubesModifiedGraphiteElectrode申请人姓名：刘莹指导教师：刘奇副研究员合作导师：专业名称：生态学研究方向：生态环境工程所在学院：生命与环境科学学院论文提交日期2018

2、年3月杭州师范大学硕士学位论文致谢致谢光阴似箭，日月如梭，转眼间，已经临近毕业。心怀诸多不舍也诸多感恩。在此临别之际，我要真诚感谢那些曾经指导过、帮助过、鼓励过我的人。是他们做我的引路人和坚强的后盾，才有今天的我以及我的一切。本论文工作从选题、实验以及最后成文都是在导师刘奇老师的悉心指导和严格严格要求下完成的，工作中每一步进展和成绩都凝聚着刘老师的智慧和心血。刘奇老师渊博的知识、开阔的视野以及敏锐的思维给予我学业上的无限启迪。同时老师严谨治学的态度和刚正不阿的品格使我在潜移默化中受益终身。我对刘老师的知遇之恩与教诲之情铭记于心，在此，谨祝老师家庭美满，事业顺

3、心，桃李满天下！在课题研究过程中，石陆娥老师、俞志明老师、金仁村老师、张杭君老师、沈晨佳老师、辛越勇老师等都给予我很多指导与帮助，在此向他们献上我最诚挚的敬意与感谢！在研究生生涯中，我还要感谢刘倩师姐、张瑜师姐、王庆强师兄对我学习方面的指点和关照。感谢徐雨晴、余丹、杨李平、蔡爽、郑夏萍、吕超、黎贤铭、玉敏杰等本科生的支持与共进。感谢许亚杰、徐佳佳和卢珏三年中的陪伴、包容与关爱！最后衷心感谢闺蜜和旧友的理解与鼓励。感谢我的父母与妹妹等亲人，感谢他们多年来的默默付出与鼎力支持！刘莹2018年3月30日于杭州师范大学I杭州师范大学硕士学位论文摘要摘要二氯甲烷（DC

4、M）电生物脱氯在环保上具有重要的学术价值。本文由野生菌MethylobacteriumrhodesianumH13菌株中克隆了DCM脱氯酶基因（dcm），并构建了原核表达重组菌E.coilBL21-pET28b(+)-dcm，在此基础上对DCM脱氯酶进行了生物信息学分析。利用亲和层析结合超滤离心的方法得到了高纯度相对较高的DCM脱氯酶，并采用脱卤素酶-甲醛脱氢酶偶联NADH显色法检测了酶比活力。采用凝胶固定化法制备了海藻酸钠包埋DCM脱氯酶负载碳纳米管修饰石墨电极（SA/De-MWCNT-GE），对其在DCM的还原脱氯反应中的可能降解途径进行了探讨。主要结论

5、如下：（1）重组质粒测序结果显示，克隆的基因片段全长864bp，编码288个氨基酸，预测分子量为33kDa。克隆的基因片段与MethylobacteriumextorquensDM4的脱氯酶序列比对显示第62位碱基由胞嘧啶替换成了鸟嘌呤，碱基的差别甚微。（2）DCM脱氯酶分子式为C1505H2255N403O430S7，蛋白质等电点为6.35，是一个存在于细胞质中的稳定的亲水性蛋白质。此外，DCM脱氯酶是一个具有卷曲结构的蛋白质，α-螺旋占53.47%，为蛋白质最大量的结构元件，52.43%的氨基酸残基暴露于蛋白的表面。DCM脱氯酶以二聚体形式存在，且属于θ

6、类型的谷胱甘肽转移酶，对底物的选择性较强。催化通道半径和长度均为1.4Å，催化通道和催化口袋中的氨基酸分别为Glu42和Val43。DCM脱氯酶氨基酸序列在微生物中有同源性高，活性中心较为保守，功能域预测得到8个潜在活性位点。（3）DCM脱氯酶为可溶性胞内酶，在经IPTG诱导的重组菌中能够高效表达，蛋白分子量大小约为33kDa，与预测值相符。亲和层析结合超滤离心纯化的纯酶液比活力为0.03647±0.00084U/mg，较亲和层析纯化得到的酶液和重组菌粗酶液分别约提高了2和7.4倍，该纯酶液可在-20℃甘油体系中长期保存且酶活稳定。（4）当脱氯反应体系中pH

7、，温度和DCM初始浓度分别为7，298K和10mM时，反应进行20h后DCM去除率和平均电流效率分别达到49.2%和79.4%。在电生物还原脱氯过程中，反应物和产物的碳平衡在98-102%的范围之间。通过中间产物的分析，推测了DCM可能的降解途径。关键词：DCM脱氯酶；异源表达；酶活力；电生物脱氯；平均电流效率II杭州师范大学硕士学位论文ABSTRACTABSTRACTThedichloromethane(DCM)bioelectrochemicaldechlorinationhasimportantacademicsignificance.Inthiswo

8、rk,theDCMdehalogenasegene(