齐墩果酸、鞣花酸与拉米夫定体外联合抗hbv作用研究

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1、万方数据第31卷第4期2009年12月湖北大学学报(自然科学版)JournalofHubeiUniversity(NaturalScience)V01．31No．4Dee．，2009文章编号：1000—2375(2009)04—0426—04齐墩果酸、鞣花酸与拉米夫定体外联合抗HBV作用研究韩凤梅，张晓雷，陈勇(湖北大学中药生物技术湖北省重点实验室，湖北武汉430062)摘要：为了观察拉米夫定(3TC)分别与齐墩果酸(OA)、鞣花酸(EA)联合应用抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用，在HepG2．2．15细胞培养液中分别加

2、入适当浓度的3TC、OA、EA、3TC+OA、3TC+EA含药培养液，每4d换用含同等药物浓度的新鲜培养液，第8d末取上清液，用ELISA法检测上清液中HbsAg和HbeAg的量，计算各药对HepG2．2．15细胞分泌HbsAg和HbeAg的抑制率，并用金正均Q值法分析联合用药的抗HBV效果．结果表明，3TC与OA合用，对HbeAg的抑制表现为拮抗作用，在低浓度时对HbsAg的抑制为协同作用，其它浓度时均为相加作用．3TC与EA合用，对HbeAg、HbsAg的抑制均呈相加作用，但对HbeAg的相加作用在所取浓度范围内比

3、较稳定(Q值在0．85一O．90之间)，对HbsAg的相加作用则随药物作用浓度的增大而逐渐减弱．关键词：齐墩果酸；鞣花酸；拉米夫定；乙型肝炎病毒中图分类号：R969．2文献标志码：AD01：i0．3969／j．issn．1000—2375．2009．04．025拉米夫定(3TC)在国内广泛用于治疗慢性乙型肝炎，以其口服方便、不良反应少而受欢迎，但它不能根治慢性肝炎，主要的问题是持续应答率较低，停药后复发率高．参考治疗艾滋病的经验，人们推测合理的联合药物治疗可以提高抗病毒药物的疗效[1]．由于拉米夫定的诸多优点，目前大多

4、数联合治疗乙肝病毒试验均将其纳入，得到了广大医务人员的认同，并成为新的研究热点【2q]．近来有文献报道齐墩果酸(oA)和鞣花酸(EA)均有一定的抗HBV作用[争6

5、，但尚不清楚3TC与OA、EA联合应用是否有利于抗HBV治疗．为此，本实验以HepG2．2．15细胞为模型，对3TC分别与oA、EA联合应用抗HBV作用进行了初步研究．1实验材料1．1细胞HepG2．2．15细胞由武汉大学医学病毒国家重点实验室馈赠，并用含10％胎牛血清(杭州四季青科技有限公司)、380mg／LG418、100mg／L青霉素、100mg／L链

6、霉素的DMEM液(GBICO公司)培养，pH值用5％NaHC()3调至7．2—7．4．1．2药物和试剂拉米夫定(购自北京诺德恒信科技有限公司，纯度≥98％)用超纯水溶解，加培养液稀释至l000mg／L，滤过除菌后备用．鞣花酸(购自天津一方科技有限公司，纯度≥98％)用二甲亚砜(DMSO)溶解，加培养液稀释至250mg／L，滤过除菌后备用，DMSO最终浓度小于1％．齐墩果酸(购自中国药品生物制品检定所，纯度≥98％)用DMSO溶解，加培养液稀释至1．0g／I。，滤过除菌后备用，DMS()最终浓度小于1％．二甲亚砜(DMS

7、O)(Sigma公司)．四甲基偶氮唑盐(简称MTT，Sigma公司产品)．乙型肝炎病毒s抗原诊断试剂盒和乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒(购自上海实业科华生物技术有限公司)．收稿日期：2009一05—19基金项目：病毒学国家重点实验室开放研究基金(Ill一2005010)资助作者简介：韩风梅(1967一)，女．副教授。Email：cyl01610@yahoo．cn万方数据第4期韩凤梅等：齐墩果酸、鞣花酸与拉米夫定体外联合抗HBV作用研究4272实验方法2．1实验分组以在HepG2．2．15细胞培养液中加入3TC+OA、3T

8、C+EA作为联合用药组，以在培养液中只分别加入3TC、OA及EA作为单药对照组，以在培养液中不加入上述任何药物作为空白对照组．根据文献[5—7]报道及预实验结果，各组具体用药浓度见表l、表2．2．2药物对HepG2．2．15细胞毒性的测定方法将培养的HepG2．2．15细胞用0．25％的胰蛋白酶消化成单个细胞，吹打混匀后，配制成1×105个细胞／mL接种到96孔细胞培养板，每孑L100gL；于37℃、5％COz培养箱中培养24h后弃去上清液，换用含不同药物浓度的培养液继续培养，每个浓度重复3孔，每孑L200肛L，每4d

9、换用含同等药物浓度的新鲜培养液，共培养8d；第8d末吸去上清，每孑LJJD入5g／LMTT溶液20肛L，继续培养4h；中止培养后弃上清，每孔加入DMSO150pL，振荡10min；在酶标仪上选择490nm，以空白孔调零(空白孔只加DMSO)后测定各孔吸光度A值．以药物对HepG2．2．15细胞生长的抑制率判定药物对细胞的毒性．细胞