人gdnf在甲醇酵母及家蚕幼虫中的表达

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1、!"卷#期生物工程学报’()*!"+(*#$%%%年&月!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12,-./-01-2$%%%!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!人!"#$在甲醇酵母及家蚕幼虫中的表达陈哲宇!，$黄爱军!何成!路长林!吴祥甫$!（第二军医大学神经生物学教研室上海$%%466）$（中国科学院上海生物化学研究所上海$%%%6!）摘要将人胶质细胞源性神经营养因子（57+8）基因克隆入酵母分泌型表达载体.9:;&<中，酶切线性化后电穿孔导入酵母细胞进行整合，经5

2、4!=筛选得到多拷贝转化子，甲醇诱导表达。将人57+8基因克隆入昆虫病毒转移载体.>?@9A<=中，与线性化>03>?@9A<"修饰病毒基因组7+A共转染家蚕细胞，经体内重组，筛选到重组病毒。用重组病毒感染家蚕幼虫，#B后收集血淋巴。,7,39A5C和蛋白质印迹杂交结果证实了酵母培养上清液及家蚕幼虫血淋巴中含有57+8蛋白。活性研究表明，甲醇酵母及家蚕幼虫表达的57+8蛋白能促进多巴胺能神经元的存活和突起生长。关键词胶质细胞源性神经营养因子，甲醇酵母，重组家蚕核型多角体病毒，基因表达，多巴胺能神经元中图分类号DE=&文献标识码A文章编号!%%%36%"!（$%%%）%#3

3、%#"!3%#胶质细胞源性神经营养因子（5)F?)@-)))FG-B-3>0+细胞、修饰的家蚕核型多角体病毒>03>?@32FH-BG-I2(/2(.JF@K?@/(2，57+8）能特异性促进多巴9A<"7+A、转移载体.>?@9A<=为本实验室保存。胺能神经元存活［!］，同时又是一种运动神经元营养.>,<357+8质粒为本实验室构建并保存。5,!!#因子［$］，并且在多巴胺能神经元或运动神经元受到酵母菌株和.9:;&<表达载体购自:GHF/2(M-G。损伤后，能促进其修复和再生。近年来的研究表明，%&%&’酶与试剂：限制酶、L47+A连接酶、57+8极有希望用于帕金森氏

4、病、脊髓侧索硬化症54!=、低熔点琼脂糖、NF.(K-@/FG试剂、切口平移探等神经系统退行性疾病的治疗［6，4］。针标记试剂盒、>;:9、+>L为5F1@(>ON公司产品。天然的57+8含量极低，给分离纯化带来相当L?P7+A聚合酶为生工公司产品。鸡抗人57+8的困难。因此，不少实验室致力于寻找一个合适的多抗、碱性磷酸酶耦联的羊抗鸡:M5及57+8表达系统，从而表达出大量有活性的57+8蛋白。CN:,A检测试剂盒为92(0-M?公司产品。QR1(GB3我们已克隆了57+8基因并在大肠杆菌得到高表+膜及［!36$9］3B;L9购自A0-2SJ?0。T3M?)及达［#］。但

5、是，57+8在大肠杆菌中的表达产物以包.()R3N3)RSFG-购自,FM0?公司。其余试剂均为国产涵体形式存在，需变复性后才具有生物活性。同时，分析纯。大肠杆菌表达系统还存在内毒素污染等问题，因而%&%&(培养基：U7（!6V4M／NW+>，4X!%Y4M／N生影响了表达产物的临床应用。甲醇酵母（3#0"#+物素，$%M／N葡萄糖，!#M／N琼脂糖），UU（!6V4M／NY44+&/(*#&）及杆状病毒表达系统因其稳定、高效、表达W+>，4X!%M／N生物素，#0N／N甲醇，!#M／N琼量高、能正确完成蛋白质翻译后加工而成为理想的脂糖），W97（!%M／N酵母膏，$%M

6、／N蛋白胨，$%M／N真核蛋白表达系统［"，E］。本文介绍的工作就是将人葡萄糖，!#M／N琼脂糖），>U5W（!%M／N酵母膏，57+8基因在3#0"#+4+&/(*#&及家蚕幼虫中进行表达。$%M／N蛋白胨，%V!0()／N磷酸钾缓冲液.Q"V%，Y4!6V4M／NW+>，4X!%M／N生物素，!%M／N甘油），%材料和方法>UUW（将>U5W中!%M／N甘油替代为#0N／N甲%&%材料醇），含!%Z胎牛血清的7UCU培养基及>$E无血%&%&%菌株、细胞株和质粒：大肠杆菌L5!、家蚕清培养基用于多巴胺能神经元培养，含!%Z胎牛血收稿日期：!&&&3!$3%#，修回日期

7、：$%%%3%43!%。基金项目：国家重点基础研究规划“脑功能和脑重大疾病的基础研究”（5!&&&%#4%%#）及国家自然科学基金资助。生物工程学报!I卷7I?清的!"#$!%%培养基用于&’(细胞培养。测。!"#方法!"#"(表达产物的活性鉴定：利用.)(Q能促进!"#"!基因操作：质粒抽提、酶切反应、)(*片段体外原代培养的多巴胺能神经元存活及分化进行生回收、连接反应、细菌转化、+)+,-*./、0123145印物活性测定。多巴胺能神经元原代培养参照文献迹等技术均参照文献［6］略加修改进行。［!%］进行。取胎鼠中脑多巴胺能