人dna 拓扑异构酶ⅰ在毕赤酵母中的表达及发酵条件优化

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1、!"卷!期生物工程学报%&’(!")&(!!""#年$月!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12*+,-.!""#!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!人!"#拓扑异构酶!在毕赤酵母中的表达及发酵条件优化2，!2#2$2"杨国武袁保红何国平戴欣林永成周世宁（2中山大学生命科学学院生物化学系，广州:2"!1:）（!深圳市计量质量检测研究院，深圳:20"::）（$中山大学化学与化工学院天然产物研

2、究室，广州:2"!1:）（#香港理工大学应用生物与化学技术系，香港）摘要为了在体外以人D)5拓扑异构酶!（.6&E&!）为靶位进行抗肿瘤化合物的快速筛选，用F6/GHF法从I7’+细胞中克隆了.6&E&!基因JF8并在毕赤酵母中首次成功表达，表达产物可分泌到发酵上清，易于制备。蛋白酶5缺陷的重组酵母（K*D/.6&E&L）分泌重组酶的能力比具有蛋白酶5活性的重组酵母（M$$/.6&E&L和N*/.6&E&L）更高。通过发酵条件的优化，使用O**P（EI1Q!:），于!"R，每隔!#.补加"Q:S

3、（3T3）的甲醇和$S（3T3）的营养液，K*D/.6&E&!诱导1!.后可表达最高的酶活力（#$"""ATY7,CZ’&Y分析显示，表达的.6&E&!为32[D蛋白，无糖基化修饰。关键词人D)5拓扑异构酶L，分泌表达，优化，毕赤酵母中图分类号104文献标识码5文章编号2"""/$"4（2!""#）"!/"202/"4D)5拓扑异构酶（D)5Y&E&=>&<7,+>7）通过调节纯化步骤也十分复杂，且在分

4、离纯化过程中酶活性D)5的拓扑结构，在细胞代谢过程中起着极重要的极易丧失。为了获得足够的酶供研究和应用，本文作用，如D)5复制、基因转录、D)5重组、有丝分裂应用了毕赤酵母表达系统。毕赤酵母（4#0"#+(［2，!］等。D)5拓扑异构酶组成了Y]E7!和Y]E7"两5+&/(*#&）有#信号肽引导，表达产物能分泌到发酵液个家族。6]E7!酶改变D)5双螺旋的拓扑结构时，中，易于纯化；它还有甲醇诱导型强启动子，外源蛋［2!，2$］不需要56G供能，一次仅切割D)5双链中一条链。白的表达产量高。本研

5、究首次在毕赤酵母中成功表达了.6&E&!全长蛋白并进行了表达条件的优6]E7"酶改变D)5双螺旋的拓扑结构时，需要56G［$］化，表达产物性质稳定，产量较以往的方法高。表达提供能量，一次同时切开D)5的双链。除细菌的产物经过简单的超滤制备，即能满足体外以.6&E&!D)5拓扑异构酶"（即旋转酶，V],+>7）能将负超螺旋为靶位抗肿瘤化合物的快速筛选。引入D)5中，其余D)5拓扑异构酶能松驰D)5链［2］中的超螺旋。真核生物D)5拓扑异构酶!或"被$材料与方法证实为多种抗肿瘤药物的有效靶位，细菌的

6、V],+>7$%$材料也是临床上广泛使用的喹喏酮类抗生素的作用靶EOF$!!、EGLH‘#5、4(5+&/(*#&K*D2240（"#&6［#，:］位。bb)*+75%5：：aF5$，*AY）、M$$（c=’BY]E7，*AY）、人D)5拓扑异构酶!（.6&E&!）为32[D的单>N*1（2.=>#+&92：：5FW#，*AY）为本室保存。6.7,<&/［4］肽，有14:个氨基酸。该酶由位于染色体!"^2!_6*K-,=EYF6/GHFK]>Y7<为W=Z-&公司产品，80(F!、［1］2$Q!

7、位点的单拷贝基因编码，在细胞中含量甚95$!、:+0!、6#D)5U=V+>7为6+N+F+公司产品。微。.6&E&!在酿酒酵母、昆虫细胞及肿瘤细胞中得一抗为抗.6&E&!的鸡LVP，二抗为兔抗鸡LVW_［0，3，2"］到了表达，但表达量都十分低，这是因为表达IFG，由珠海百奥公司生产。的具有活性的.6&E&!在宿主细胞内会影响细胞正$%&方法［22］常的代谢过程。在细胞内表达后，.6&E&!的分离$%&%$.6&E&!基因JF8（&E7C,7+B=CVd,+<7）的克隆收稿日期：!""$/"0

8、/"1，修回日期：!""$/2"/!3。基金项目：国家高技术研究发展计划（04$）专项资助项目（!""2554!"#"2）；广东省自然科学基金资助项目（"222!#）。"通讯作者。67’：04/!"/0#22"!$0；8+9：04/!"/0#"$4!2:；;/<+=’：’>>?>’@?>A(7BA(-C。LO?生物工程学报?F卷C与表达载体的构建：作者从处于对数生长期的!"#$2X1表型（甲醇利用迟缓型）重组酵母的表达：(2细胞中提取总%&’，使用()"*+,-.*/01%(345%6/1接种重