家蚕幼虫中肠细胞的原代培养

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1、万方数据PrimarycultureofmidgutcellsfromlarvaeofBombyxmori一‘‘submittedt01laeSlSsul9daoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyWuYanlei(DepartmentofAgronomy)Supervisor：LiChangyouQingdao．ChinaJune，2012万方数据学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导

2、师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。如不实，本人负全部责任。学位论文作者签名：要艳锈签字日期：、瞬石月岁‘)日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等

3、复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：鬟施秀翮签字：匀自学签字日期：卅1年∥月多口日签字日期：加f许石月；参日万方数据青岛农业大学硕士学位论文中文摘要家蚕幼虫中肠细胞的原代培养摘要中肠在昆虫生命活动中起着分泌消化液、消化食物和吸收养分的重要作用，同时也是生物杀虫剂如苏云金芽孢杆菌(Bt)、昆虫杆状病毒、凝集素和蛋白酶抑制剂等先导物的作用靶标，因此了解中肠生物学功能具有重要意义。在活体内，中肠结构的复杂性和中肠细胞之间广泛的相互作用使得中肠生理学、病理学和毒理学的研究变得困难，而离

4、体细胞培养为研究中肠细胞的功能提供了简单、快速和准确的手段，为病原和寄主相互关系的研究提供了理想的体外模型。但是中肠细胞的离体培养存在着细胞状态不好、难以成活、难以传代等问题。究其原因，主要是由于中肠细胞的分化程度高有关，对离体培养的条件要求苛刻，特别是原代培养的培养基营养成分不充分造成细胞难以成活，目前所用的培养基中尚缺乏活体培养中的某些因子；其次，中肠组织取材的时间和中肠细胞的分离方法的不合适，导致细胞状态不好，大量死亡，难以成活。针对中肠细胞离体培养中出现的难题，本论文主要对家蚕幼虫中肠细胞的原代培养进行了研究，了解昆

5、虫中肠细胞类型，测定出最适合进行离体培养的家蚕幼虫的龄期，找到中肠细胞最适合的分离方法，筛选出合适的培养基配方、血清含量及其生长调节物，为中肠细胞系的建立以及中肠生物学的研究奠定基础。主要结果如下：1对家蚕幼虫进行解剖，观察到中肠细胞有柱状细胞、杯状细胞和再生细胞，其中，杯状细胞与柱状细胞的比例为1：5。2对家蚕不同龄期的幼虫进行解剖培养，测定再生细胞的含量及其生长状态，结果表明4龄初幼虫得到的再生细胞含量最高，为82．82％，为最佳的解剖适期。3分别对家蚕幼虫中肠的前、中和后部进行培养，结果表明，中肠前部的再生细胞与杯状细

6、胞的比例最高，为13．2：1，同时再生细胞含量也最高，为67．18％；中肠中部的再生细胞与杯状细胞的比例为9．4：1，再生细胞含量为60．11％；中肠后部再生细胞与杯状细胞的比例为11：l，再生细胞含量为58．97％；但对前、中和后部进行方差分析，发现前部位与中、后部并没有显著性差异。万方数据青岛农业大学硕士学位论文中文摘要4用TNM—FH、IPL．41、TC．100、Grace4种培养基分别培养家蚕中肠细胞，观察中肠细胞的生长状态，测定细胞密度和细胞存活率，结果表明，TNM．FH培养基更适合家蚕中肠细胞的离体培养，在第3周

7、的时候，细胞密度为7．67x104cells／mL，细胞存活率为21．10％。5配制了含有o％、5％、10％、15％、20％-血-清的五种梯度的培养基，分别用这5种培养基来培养家蚕中肠细胞，结果表明，血清浓度为15％时更适合家蚕中肠细胞的离体培养，细胞生长状态比较好，在第三周时，细胞密度为6．0×104cells／mL，细胞存活率为18．15％。6把血淋巴、条件培养基和FBX分别加入培养基，对家蚕中肠细胞进行培养，结果表明血淋巴、条件培养基和FBX都在不同程度上促进中肠细胞的离体培养，但三者并没有显著性差异。7中肠细胞的分离

8、方法有很多种，本实验主要采用了机械分离法和酶解法，其中酶解法用了Collagenase、DispaseII、HyQTase、Trypsin4种酶，通过比较细胞生长状态、细胞密度和细胞存活率，表明机械分离法相对来说，比酶解法效果要好；而酶解法中，HyQTase法比其他三种酶法效果要好。8用B