核酸外切酶iii辅助信号放大荧光生物传感器检测dna

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1、学校代码10530学号201510141468分类号O657.3密级硕士学位论文核酸外切酶III辅助信号放大荧光生物传感器检测DNA学位申请人袁丹指导教师陈效兰副教授学院名称化学学院学科专业化学研究方向分析化学二〇一八年五月ExonucleaseIII-AssistedSignalAmplificationFluorescenceBiosensorforDetectionofDNACandidateyuandanSupervisorAssoc.Prof.XiaolanChenCollegeChemistryColleg

2、eProgramChemistrySpecializationAnalyticalChemistryDegreeMasterofScienceUniversityXiangtanUniversityDateMay，2018摘要摘要核酸外切酶III（ExoIII）对双链DNA有特定的水解作用，沿3‘→5‘的凹陷端方向逐步剪切单核苷酸，利用其剪切特性可以提高DNA传感器的灵敏度。脱氧核糖核苷酸（DNA）序列是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分，作为遗传指令，引导生物发育与生命机能运作，故而，在生物研究、临床诊断和生物应用等方

3、面，核酸的检测尤为重要。近年来，发展起来的DNA荧光生物传感器具有易操作和高灵敏的优点，因此成为最广泛使用的检测方法之一。2-氨基嘌呤（2-aminopurine，2-AP）是一种腺嘌呤的类似物，与腺嘌呤互为同分异构体，拥有良好的荧光特性；金属纳米簇是一种新型的纳米材料，具有尺寸小、稳定性好、斯托克斯位移大、生物相容性好等优点，近年来被广泛地应用于生物、化学等领域；水溶性核酸染料硫黄素T(2-[4-(二甲基氨基)苯基]-3,6-二甲基苯并噻唑鎓氯化物，ThT）是一种特异性识别G-四联体DNA结构的染料。本论文基于核酸外

4、切酶III的水解作用，利用荧光基团2-氨基嘌呤（2-AP）、金纳米簇（AuNCs）以及核酸染料硫磺素T（ThT）物质的光谱特性构建了几种新型荧光生物传感器用于DNA的检测。具体研究包括了以下内容：（1）基于核酸外切酶III和2-氨基嘌呤（2-AP）荧光探针快速检测p53突变基因。首先设计一条2-AP标记的探针DNA（cDNA）及与其部分互补的DNA（bDNA）,形成cDNA/bDNA双链传感器。当加入目标DNA（tDNA）后，发生链置换形成更加稳定的3‘端平末端的cDNA/tDNA双链DNA，此双链DNA在ExoⅢ的水

5、解作用下，释放出tDNA且不断产生游离的2-AP。释放出来的tDNA诱发新一轮的酶水解反应，使反应体系荧光信号强度不断增强，从而实现体系荧光信号放大。p53浓度在1.0-850nM范围内与体系荧光的变化值（ΔF）具有良好的线性关系，检出限为104pM。该方法具有分析快速，操作简单，高选择性和检出限低等特点。（2）基于核酸外切酶III以DNA为模板的金纳米簇荧光传感器检测HIV-1。通过利用DNA为模板合成金纳米簇，构建DNA-AuNCs荧光探针，利用ExoIII对双链DNA的剪切特性，一方面ExoIII能剪切HIV-1

6、与其部分互补的DNA杂交形成的双链DNA，从而实现HIV-1的循环，达到提高灵敏度的目的；另一方面在ExoIII的作用下，不断产生与DNA-AuNCs荧光探针互补的增强其信号的DNA序列（G-DNA），从而实现体系荧光信号的放大，根据体系荧光信号的变化（ΔF）来检测HIV-1DNA。实验表明在1.0-400nM范围内ΔF与HIV-1浓度的对数呈线性，检出限为154pM。该方法简便，低成本，高灵敏，特异性好，I摘要可用于实际样品检测。（3）基于核酸外切酶III链式放大技术荧光比色法高灵敏检测HBV。当HBV（tDNA）存

7、在时，tDNA相继打开两个发夹DNA（HP1、HP2），形成3‘端平末端的HBV-HP1–HP2双链结构。在ExoIII的作用下，分别释放出tDNA、HP2部分互补的DNA（pDNA）及能形成G-四联体的DNA（G-DNA）。tDNA与pDNA分别参与I，II循环，在循环I和循环II自发进行的基础上，实现循环放大。当核酸外切酶III协助的循环完成，释放的G-DNA可分别与硫磺素T（ThT）和氯化血红素（Hemin）结合形成G-四联体复合物。其中ThT/G-四联体可以产生明2-显增强的荧光信号，而Hemin/G-四联体在

8、双氧水存在下，可以催化氧化ABTS，使溶液颜色明显改变，测其紫外可见吸收光谱。据此，可以用荧光法、比色法和紫外可见光谱法检测HBV。其中，荧光法的灵敏度最高，在0.2-50nM范围内ΔF与HBV的浓度呈线性，检出限为54pM。关键词：核酸外切酶III（ExoIII）；2-氨基嘌呤（2-AP）；金纳米簇（AuNCs）；硫磺素T（Th