eif5a对细胞增殖的影响

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1、论文答辩日期：2013年5月11日目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．i英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3前言．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5日U吾．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．18当日才≮⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．上石分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．20参考文献⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．22附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．23致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．24综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯．．25学位论文独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35温州医学院硕士学位论文摘要eIF5A对细胞增殖的影响目的真核细胞翻译起始因子5A(eukaryotictranslationinitiationfactor5A，eIF5A)是一种真核生物细胞内的小分子蛋白，在细胞生长、发育、衰老等多方面，尤其对是细胞增殖起着非常重要的作用，同时核糖体也能够被其刺激发挥功能，但是对eIF5A在各种途径中是如何发挥调控机制仍不甚清楚。本实验在于构建人eIF5A基因的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达pGEx一4T一卜eIF5A融合蛋白后，将正确表达的融合蛋白转染至小鼠骨髓间充质

3、干细胞来研究其对细胞增殖的影响。方法以pCMV6一XL4一eIF5A作为模板，经PCR技术扩增目的片段，将获得的目的片段先连接到T载体，再经过内切酶(EcoRI、XhoI)剪切后，将带有酶切位点的目的片段，连接到预先用相同内切酶处理后的原核表达载体pGEX一4T一1上，经双酶切鉴定、DNA测序检测插入序列的正确性。将测序正确的重组表达质粒pGEX一4T一卜elF5A转化到E．coliBL21内，在一定条件下经过一定浓度IPTG诱导后，收集足量菌体，通过超声破坏菌体的方法提取细菌目的蛋白，测浓度后经过GST琼脂糖珠pull—down纯化，再使用SDS-PAGE电泳分析以及we

4、sternblot检测人elF5A蛋白的表达。然后，在elF5A鉴定正确后通过蛋白转染试剂EntransterTM—K转染至小鼠间充质干细胞内，并通过MTT分析检测来研究eIF5A对细胞增殖的影响。结果成功构建了重组表达质粒pGEX-4T一卜elF5A后，经DNA测序证实插入序列与设计完全一致，GSTpull—down后电泳分析以及westernblot结果说明大肠杆菌BL21诱导后表达出人elFSA的glutathioneS—transferase(GST)融合蛋白。MTT分析研究初步证明重组elF5A蛋白在细胞增殖过程中发挥重要作用，能够促进细胞增殖，并且与对照组差异具

5、有统计学意义。结论本研究成功构建了融合表达GST的elF5A的原核表达载体，获得可稳定表达elF5A的原核菌株，并建立了能在E．coliBL21内表达带有glutathioneS—transferase(GST)标签的elF5A融合蛋白的琼脂糖珠纯化系统，1温卅I医学院硕士学位论文有利于进一步揭示elF5A的功能，及其在蛋白翻译过程中的调控作用研究，为临床上探讨皮肤损伤修复的新方法奠定研究基础。转染了eIF5A蛋白的小鼠骨髓间充质干细胞的与对照组相比增殖情况明显增高，并且差异有统计学意义，为eIF5A在细胞生长发育中的作用提供了一个有力证据，并且对研究人eIF5A蛋白的结构

6、和生理功能如促进创伤修复提供帮助。[关键词]真核起始因子5A：质粒；融合蛋白温州医学院硕士学位论文AbstracttheEffectofeIF5AonCellProliferationObjectiveEukaryoticcelleukaryoticinitiationfactor5A(eIF5A)isasmallproteins，incellgrowth，development，aging，andmanyother，inparticular，whichplaysaveryimportantroleofcellproliferation，meanwhile，ribosome

7、Callbestimulatedtofunction．But，inavarietyofways，howdoeselF5Aplayaregulatorymechanismisstillunclear．Inthisexperiment，wearegoingtOestablishrecombinantprokaryoticexpressionvectorpGEX-4T-1-elF5Aandexpressthefusionprotein，inordertoexploretheeffectofeIF5Aonprolifera