斜带石斑鱼脑肠肽及其受体的克隆与mrna表达研究

《斜带石斑鱼脑肠肽及其受体的克隆与mrna表达研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中山大学硕士学位论文斜带石斑鱼脑肠肽及其受体的克隆与mRNA表达研究答辩委员会主席：委员：作者：陈廷专业：水生生物学导师：李文笙教授中山大学生命科学学院水生经济动物研究所中国广州，5102752007年5月斜带石斑鱼脑肠肽及其受体的克隆与mRNA表达研究论文题目：斜带石斑鱼脑肠肽及其受体的克隆与mRNA表达研究专业：硕士生：指导老师：水生生物学陈廷李文笙教授摘要脑肠肽(ghrelin)是一种新发现的胃肠道激素，通过作用于其受体GHSR．1a，在哺乳类和鱼类中均起到促进生长、促进摄食以及调节脂肪代谢等生物学功能。本文在斜带石斑鱼(

2、Epinepheluscoioides)中，克隆了ghrelin和两种形式GHSR全长cDNA序列，以及它们的基因序列，并通过Northernblot和RT-PCR分析了ghrelin和两种形式GHSRmRNA在各组织和胚胎发育各阶段的表达情况，还利用原位杂交定位了脑区的GHSRmRNA表达细胞。首先，本文利用RT-PCR和RACE方法，在下丘脑中克隆了两种形式的斜带石斑鱼GHSR全长cDNA序列，命名为gpGHSR·la，和gpGHSR-lb。其中gpGHSR-la编码一个383氨基酸的七次跨膜蛋白而gpGHSR-lb编码一个

3、303氨基酸的五次跨膜蛋白。还克隆了斜带石斑鱼GHsR基因序列，由两个外显子和一个内含子组成，gpGHSR—la由两个外显子所编码，gpGHSR-lb由第一个外显子和部分内含子序列编码，引起提前终止。相似度分析表明，GHSR-la跨膜区Ⅱ和跨膜区Ⅲ之间的膜外区，在各物种中高度保守，推测该区域可能是与配体必须的。此外还构建了gpGHSR．1a和．1b的原核表达载体。进一步利用RT-PCR和RACE方法，在胃中克隆了斜带石斑鱼前脑肠肽原(preproghrelin)全长cDNA序列。preproghrelincDNA编码一个102氨

4、基酸的前斜带石斑鱼脑肠肽及其受体的克隆与mRNA表达研究体蛋白，包括26氨基酸的信号肽，20氨基酸的成熟肽和56氨基酸的C末端多肽，除了成熟肽功能位点上的6个氨基酸(GxSFLSP)外，鱼类各物种preproghrelin的氨基酸序列显示高度差异。斜带石斑鱼ghrelin基因包含四个外显子和三个内含子，其中第一个外显子和二个外显子编码了ghrelln成熟肽，与罗非鱼以及黑鲷中研究相类似，而其他鱼类和哺乳类则在5’非编码区多出一个外显予。根据GHSR．1a和ghrelin构建的进化树，均表明斜带石斑鱼在进化地位上与罗非鱼及黑鲷位于

5、同一支，而哺乳类则位于另一端。本文利用Northernblot和半定量RT-PCR检测了ghrelin和两种形式GHSRmRNA的表达情况。Northernblot和RT-PCR检测发现，ghrefinmRNA只在胃中有表达，并且只有一个转录本。半定量RT-PCR的分析表明，gpGHSR-lamRNA主要在各脑区中表达，以下丘脑和垂体最高；而gpGHSR．1bmRNA则广泛分布于脑区和各外周组织中。两种GHSR转录本与ghrelinmRNA的组织分布情况显示，gpGHSR．1a可能介导着ghrdin促生长和促摄食方面的生物学功能

6、，而gpGHSR-lb则与ghrelin的作用无关。ghrelinmRNA在下丘脑中没有表达的情况，只在另外两种鲈型且鱼类罗非鱼和黑鲷中报道，可能与它们缺少一个外显子的特殊基因结构有关。在胚胎发育阶段，gpGHSR-lamRNA从神经胚期开始表达，并在出膜3天后逐步升高，gpGHSRolbmRNA则从囊泡期开始一直以稳定水平表达，而ghrelin在出膜后3天开始表达。胚胎发育阶段mRNA的表达情况同样表明ghrelin与gpGHSR-la有功能上的相关。另外，利用原位杂交方法对斜带石斑鱼脑部的gpGHSRmRNA表达细胞进行了定

7、位。与RT-PCR结果一致，原位杂交同样证明gpGHSRmRNA表达细胞在脑部各区中均存在，而且以下丘脑和垂体中信号最强。关键词：斜带石斑鱼、脑肠肽、促生长激素释放素受体、cDNA克隆、基因结构、mRNA表达水平、原位杂交Ⅱ斜带石斑鱼脑肠肤及其受体的克隆与mRHA表达研究TITLE：CloningandmRNAExpressionCharacteristicsofGhrelinanditsReceptorinOrange-spottedGrouper(Epinepheluscoioides)Major：hydrobiologyN

8、ame：ChenTmgSuperviosor：Prof．LiWen-ShengAbstractGhrelinisanovelgastrointestinalhormonewhichactsitsbiologicalfunctionsuchasstimulatin