衣壳蛋白对烟草脉带花叶病毒侵染和致病力的影响

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山东农业大学硕士学位论文衣壳蛋白对烟草脉带花叶病毒侵染和致病力的影响姓名：杨炳辉申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：李向东20120612 山东农业=』：学而CA-k学位论文中文摘要烟草脉带花叶病毒(Tobaccoveinbandingmosaicvirus，TVBMV)属于马铃薯Y病礴属(PoO八，irus)病毒，近几年在我国烟草上的发生有上升和蔓延的趋势，其衣壳蛋白(COalprolein，CP)在病毒致病力和侵染中发挥着重要作用，主要参与蚜传、包装病毒粒子并调节RNA的复制、细胞间运动和系统侵染、症状表现等过程。本研究通过定点突变等方法获得了TVBMVCP的12个突变体，利用农杆菌共浸润的方法分析了这些突变刈’病毒致病力的影响。与野生型的CP处理相比，92位的丝氨酸(Ser92)突变为Ala后，症状及绿色荧光并未发生变化，而突变PbAsp和His后，症状及绿色荧光明显的减弱：122位的色氨酸(Trpl22)突变成为Lys以及192位的精氡酸(Ar9192)突变为Cys后，症状及绿色荧光只在注射叶片出现，说明突变影响了病毒的长距离移动，当T印122牙NAr9192分别突变为Ala：；}NGlu后，症状及绿色荧光均消失，说明突变对于病毒是致死的：225位的赖氨酸(I．ys22’)突变成为Ala和Cys后，只在注射叶片中检测到病毒粒子的存在，说明突变影响了病毒的长距离移动，在突变为Glu后，无论注射叶片还是系统叶片，均未发现症状以及荧光的出现，说明这种突变对于病毒是致死的。利用PoleBio．InformatiqueLyormais数据库进行的二级结构预测表明，以上突变均可能导致CP构象的变化。这些结果表明，Ser92、’I．】．P122、Arg旧2、Lys27’这四个位点在病毒侵染和致病过程中有重要作用。关键词：CP；定点突变；农杆菌共浸润；长距离移动；致病力 农壳蛋白对烟草脉带花叶病毒侵染和致病力的影响Effectsofcoatproteinoninfectionandvirulenceoftobaccovein■'●●baiidmRmosalCVlrusAbstractTobaccoveinbandingmosaicvirus(TVBMV)isonespeciesofthegenusPotyvirus．ThelossescausedbyTVBMVhadbeenincreasingduringtherecentyears．Thecoatprotein(CP)playsanimportantroleinthevirusinfectioncycles，suchasaphidtransmission，replication，assembly，movementandsystemicinfection．Inthestudy，twelvemutantsofTVBMVCPwasobtainedviasite—directedmutagenesisandanalyzedfortheiractivitiesonviruspathogenicityviaagroinfiltration．’ComparedwiththatofwildtypeCP，treatmentwithsubstitutionmutationofSer92toala92resultedinnoobviouschangeinsymptomandgreefluorescence，treatmentwithsubstitutionofSer92toAsp92orHis92resultedinreducedsymptomsandgreefluorescence；substitutionofTrpl22toLys】22，Ar9192toCysl92’Lys225toCys225orAla225resultedinthegreenfluorescenceappearedonlyintheinocultedlesves；substitutionofTrpl22toAlal22orGlu】22，Ar9192toAlal92orGlul92andLys225toGluE25resultedinnosymptomsorgreenfluorescenceontheinocultedleavesorsystemiclesves．ThedatabasePoleBio—InformatiqueLyonnaiswasusedtopredictthesecondarystructureof12mutantproteins，thepredictionresultsindicatedthatthesecondarystructureofthemutantshadchanged．TheseresultsindicatedthataminoacidsSer92，Trpl22，Ar9192andLys225playimportantrolesinthepathogenesisofTVBMV．Keywords：CP；site—directedmutagenesis；virulence；long-distancemovementII BCMNVBMVBYVCaMVcDNACMVCPELISAGFPGUSHC．ProLMVMPNIaNIbORFP1P3PPVPSbMVPTGSPVAPVXPVYRdRp缩略词表Beancommonmosaicnecros括virus大豆普通花叶坏死病毒Bromemosaicvirus雀麦花叶病毒Beetyellowsvirus甜菜黄化病毒CauliflowermosaicviruscomplementalDNACucumbermosaicviruscoatprotein花椰菜花叶病毒互补DNA黄瓜花叶病毒外壳蛋白Enzyme-linkedImmunosorbentAssay酶联免疫吸附测定greenfluorescentproteinbeta-glucuronidasehelpercomponent-proteinaseLettucemosaicvirusmovementproteinnuclearinclusionbody‘a’proteinnuclearinclusionbody‘b’proteinopenreadingframethefirstproteinthethirdproteinPlumpoxvirusPeaseed-bornemosaicviruspost-transcriptionalgenesilencingPotatovirusAPotatovirusXPotatovirusYRNA—dependentRNApolymerase绿色荧光蛋白13．葡糖苷酸酶辅助成分．蛋白酶莴苣花叶病毒移动蛋白核内含体蛋白a核内含体蛋白b开放阅读框架第一蛋白第三蛋白李痘病毒豌豆种传花叶病毒转录后基因沉默马铃薯A病毒马铃薯X病毒马铃薯Y病毒依赖于RNA的RNA聚合酶RT．PCRreversetranscriptase-polymerasechain反转录酶．聚合酶链式反应reaction ●SELSM[VTEVTMVTuMVsizeexclusionlimit形状排阻极限Soybeanmosaicvirus大豆花叶病毒Tobaccoetchvirus烟草蚀纹病毒TobaccomosaicvirusTurnipmosaicvirus烟草花叶病毒芜菁花叶病毒TVBMVTobaccov．einbandingmosaicvirus烟草脉带花叶病毒TVMVUTRVPgYTHSZYMVTobaccoveinmotdingvirus烟草脉斑驳病毒untranslatedregion非翻译区Viralgenome—linkedprotein病毒基因组连接蛋白Yeasttwo—hybridsystem酵母双杂交系统Zucchinivellowmosaicvirus小西葫芦黄花叶病毒 山东农业大学硕士学位论文1、烟草脉带花叶病毒的研究进展．1L—JL·月fJ吾烟草脉带花叶病毒(Tobaccovein—bandingmosaicvirus，TVBMV)属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。1964年，Chin首次报道了烟草脉带花叶病毒在台湾的发生。1989．1991年间，通过对全国16个主要烟区烟草病害的调查发现，TVBMV在广东、福建、山东和云南等地为偶发病害，在贵州为次要病害(朱贤朝等，2002)。1992年，Reddick报道了TVBMV在北美烟草上的发生，并发现该病毒对部分地区烟草生产造成严重威胁(ReddickBB，1992)。1998年，张仲凯等报道了TVBMV在云南烟草上的发生(张仲凯，1998)。2004—2006年，Tian等对全国部分烟草主产区的烟草病毒病进行了调查，通过RT．PCR检测共得到12个TVBMV分离物，约占调查总样品数的30％，它们来自我国的山东、河南、安徽、陕西、云南等地。1．1TVBMV的生物学特性受TVBMV侵染的烟草叶脉两侧呈浓绿的带状花叶症状，发病严重时可造成叶脉坏死(张成玲，2010)，在田间与马铃薯Y病毒(PotatovirusLPVY)引起的症状类似，生产上常常与PVY引起的病害一起被称为“烟草脉斑病”(张仲凯，2001)。TVBMV的寄主主要是茄科植物，台湾曾用22科的69．种植物，测定对烟草脉带花叶病毒的反应，只有一些茄科植物感病。TVBMV可系统侵染番茄(Lycopersiconesculentum)、矮牵牛(Petuniahybrida)，局部侵染黄花烟草(Nicotianarustica)、苋色藜(Chenopodiumamaranticolor)、昆诺藜(Cquinoa)等(Roggero等，2000)。于晓庆研究表明，TVBMV．YND侵染苋色藜、昆诺藜后产生局部斑，侵染本氏烟、番茄、白花曼陀罗产生花叶症状，侵染三生烟和普通烟产生脉带症状，不侵染豌豆、蚕豆和反枝苋(于晓庆，2008)。王红艳对TVBMVHN39分离物的寄主范围进行了测定，结果表明TVBMVHN39能够系统侵染普通烟NC89、心叶烟、三生烟、本氏烟、辣椒及曼陀罗，在苋色藜和昆诺藜上形成枯斑，在花生和油菜上未表现症状(王红艳，2008)。TVBMV主要由蚜虫以非持久方式传播，已报道的有棉蚜(Aphisgossypii)、桃蚜(Myzuspersicae)、胡蓼钉毛蚜(CapitophorushippophaeWalker)、无肘脉蚜 衣壳蛋白对烟草脉带花叶病毒侵染和致病力的影响(HysteroneurasetariaThomus)、禾谷溢管蚜(R乃印口肠s护Jil“朋p口旃linnaeus)、麦-y．蚜(SchizaphisgraminumRondami)和艾锥尾蚜等(Trufiabdominal&Sasaki)(Fang等，1985)。1．2TVBMV的分子生物学特性1994年，日本、北美、中国台湾和云南分别运用分子检测手段对TVBMV进行了鉴定，并报道了TvBMv基因组3’．端序列(Chang等，1994)。其中，北美Tennessee株系的3’．端被测定了1902个核苷酸，包括一个含572个氨基酸残基的开放阅读框(OIU)、由183个核苷酸构成的3’．端非编码区(3’．UTR)以及Poly(A)尾(Habera等，1994)，从分子水平上明确了TVBMV的分类地位。在推导的氨基酸序列中，NIb序列与CP序列的切割位点为VVHQ／N。NIb氨基酸序列中存在依赖RNA的RNA聚合酶(RNAdependent1州Apolymerase，RdI岫)保守氨基酸序歹IJGDD和GQPSTVVDN(Domier等，1987)。Tian等根据衣壳蛋白基因可以把TVBMV分成3个与地域相关的组：GroupI，GroupII和GroupIII(Tian等，2007)。2007年Yu等获得TVBMV分离物YND的全基因组序列(GenBank登录号为EF219408)(Yu等，2007)。2010年Wang等获得了TVBMV分离物HN39的全基因组序列(Wang等，2010)。HN39和YND全序列均为9570个核苷酸，编码区的核苷酸一致率为90．O％，氨基酸一致率为95．4％，有142个氨基酸的差异，其中重要的功能性的保守基序序列基本相同。分离物YND的NIb／CP切割位点为Qm，这在马铃薯Y病毒属病毒中非常少见。HN39NIb／CP蛋白切割位点为Q／G。HC．Pro中含有比较罕见的参与蚜传的RITC基序。通过编码区序列分析表明：TVBMV病毒基因组的进化是模块进化模式(Wang等，’2010)。TVBMV的翻译起始于第147．149位的AUG起始密码子，终止于第9384．9386位终止密码子UGA，编码一个3079个氨基酸组成的多聚蛋白，分子量为348．6kDa。核苷酸全序列第147．1070位为Pl蛋白编码区，编码一个由308个氨基酸组成的分子量为35．1kDa的蛋白；第1071．2444位为HC．Pro蛋白编码区，编码一个由458个氨基酸组，成的分子量为52．1kDa的蛋白；第2445．3485位为P3蛋白编码区，编码一个由347个氨基酸组成的分子量为39．9kDa的蛋白；第3486．3644位为6K1蛋白编码区，编码一个由53个氨基酸组成的分子量为5．94kDa的蛋白；第3645．5576位为CI蛋白编码区，2 山东农业大学硕士学位论文编码一个由644个氨基酸组成的分子量为71．6kDa的蛋白；第5736．6305位为NIa-VPg蛋白编码区，编码一个由190个氨基酸组成的分子量为21．2kDa的蛋白；第6306—7031位为NIa-Pro蛋白编码区，编码一个由242个氨基酸组成的分子量为26．8kDa的蛋白；第7032．8570位为NIb蛋白编码区，编码一个由513个氨基酸组成的分子量为58．3kDa的蛋白；第8571．9386位为CP蛋白编码区，编码一个由271个氨基酸组成的分子量为30．3kDa的蛋白；P3N—PIPO为近年来在P3阅读框内新发现的一个由于移码读框而形成的新ORF，编码一个大约7kDa的蛋白。、‘P；P1HC-ProP36K1CI61<2NIa-、,’PgNIa—ProNIbCPp。b。A图1．1TVBMV基因组结构图Fig．1·1ThegenomestructureofTobaccovein—bandingmosaicvirus2、马铃薯Y病毒属病毒CP基因功能研究进展CP是马铃薯Y病毒属病毒(potyviruses)基因编码的唯一的结构蛋白。从空间结构上看CP单一肽链折叠成3个球状的结构域：高度变异的N端，含有病毒抗原决定部位；对胰蛋白酶敏感比较保守的核心区；暴露在病毒粒子表面比较保守的C端(Shukla等，1989a)。其N．端变异很大，甚至同一种病毒的不同分离物之间也可能有较大的差异，利用这个特性可以进行病毒的血清学分析，例如CP的N端区域Phel7(P)、Gly29(G)、Glu31(E)决定着PVYO的血清型，N端区域Glnl7(Q)、Glu29(E)、Glu31(E)决定着PVYN的血清型，在分离物PVY．12中CP的N端区域为Glnl7(Q)、Gly29(G)、Glu31(E)而其血清型为PVYO型，进而说明了Gly29(G)对PVY．12分离物的血清型起关键作用(ChikhAli等，2007)。另外，同种病毒不同分离物之间CP很少发生基因的重组(1％)，所以不少学者将CP的一致率作为potyviruses的分类和进化依据(Tan等，2004)，如果一致率低于80％，一般被认为是不同的种。其中心区的变异与整个基因组的变异一致，所以成为区分遗传亲缘关系的标准(Shulda等，1989b)。同种病毒不同分离物之间CP很少发生基因的重组。CP直接与寄主植物或介体接触，其最主要的功能是将病毒基因组RNA包装成病毒粒子而起保护作用，它携带 表壳蛋白对烟草脉带花叶病毒侵染和致病力的影响着重要的识别信息，参与蚜传、调节RNA的复制、细胞间移动和系统侵染、症状表现等过程(罗朝鹏，2007)。‘2．1结构蛋白CP的N端和C端区域在病毒粒子的组装中不是必需的，它们是暴露在表面的，能够被胰岛素除去而不影响CP亚基的组装。突变分析表明，CP的中心区域对病毒粒子的组装必不可少(Dolja等，1995；Dolja等，1994；Voloudakis等，2004)。CP最重要的作用就是包被病毒RNA。CP自身互作是其稳定病毒粒子结构的基础，也在多种potyviruses如烟草脉斑驳病毒(Tobaccoveinmottlingvirus，T、，MV)、马铃薯A病毒(PotatovirusA，PVA)、豌豆种传花叶病毒(Peaseed-bornemosaicvirus，PSbMV)、大豆花叶病毒(Soybeanmosaicvirus，SMV)的G7H株系中得到了验证(Guo等，2001；Hong等，1995；Kang等，2006；Kang等，2004)。在potyviruses中，一般有2000个CP亚基包被一个病毒RNA，从而装配成一个完整的病毒粒子(洪雪玉，2006)。主要是CP的核心区域参与了这个过程，因为核心部位的氨基酸突变会导致烟草蚀纹病毒(Tobaccoetchvirus，TEV)和约翰逊草花叶病毒(Johnsongrassmosaicvirus，JGMV)不能完成病毒RNA的包装(Dolja等，1994；Jagadish等，1993)。而CPC．末端的氨基酸突变并不影响李痘病毒(Plumpoxvirus，PPV)的包装(Varrelmann等，2000)。但是SMVCP的C末端对于病毒粒子的装配却很重要，因为缺失CP的C末端会导致CP。CP互作的丧失(Kang等，2006)。2．2调节RNA的复制CP能参与病毒RNA的复制，它可以通过序列非特异性的方式与病毒RNA结合，这个特性可能发生在CP包装病毒粒子的过程中，也可能发生在参与病毒RNA复制的过程中(Merits等，1998)。CP和NIb的互作更增加了它可能与病毒复制有关的证据，YTHS证明CP通过NIb上的GDD基序与NIb发生相互作用(Hong等，1995)。在没有CP的前提下表达CP基因会刺激TEV基因组的复制，但是不能复制的突变体并不能通过表达CP来恢复。CP与基因组扩增有关的区域定位于211-246位氨基酸(Mahajan等，1996)。4 山东农业大学硕士学位论文线性病毒粒子的组装机制，如potyviruses，仍然不是很清楚。PVYCP亚基即便没有病毒RNA，在适当的情况下，仍可自身组装形成非螺旋状的病毒粒子(McDonald等，1976)。2．3参与蚜虫传播’绝大多数potyvirues可由蚜虫以非持久性方式传播。CPN端区域多暴露在病毒粒子的表面，包含一个高度保守的基序Asp．AIa-Gly(DAG)，DAG基序不同位置的氨基酸均可影响蚜虫的传播特性，第一位氨基酸是酸性或中性氨基酸(Asp)，具有传播性；第二位为一个小的非极性残基(Ala)，对传播是必须的，残基变大或极性增强对传播均产生负面影响；第三位甘氨酸(Gly)是影响传播的关键，当其转变为任何其他氨基酸(即使是Ala)时均导致虫传性丧失(Atreya等，1995)。DAG基序的上下游序列对蚜虫的传毒效率也至关重要(Lopez—Moya等，1999)。虽然PotyvirusesCPDAG下游的氨基酸并不表现为高度保守，但当，ⅣMVDAG下游的Lys替换为Glu、tlkrg或Pro时，也能影响蚜虫的传播功能(Atreya等，1991)。胰蛋白酶切去TvMVCPN．端包括DAG及下游区域的氨基酸虽可使感染的植物蚜虫传播性减弱，但纯化后病毒的蚜虫传播能力并不受影响。因此DAG下游的近N端残基除了参与蚜虫传播外，还可能与TVMv的生活周期有关(Atreya等，1995)。?’Potyviruses有效的蚜传需要HC．Pro和CP的互作与蚜虫口针形成复合体(glrone等，1996；Salomon等，．1995)。DAG基序序列内或靠近该序列的基因突变后，可以阻止病毒和HC．Pro的结合，从而导致病毒不能被蚜虫传播(Atreya等，1990；杨旭光，2005)．DAG基可能为与HC．Pro相互作用的功能区，对TvMV和小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus，ZYMV)的CP基因突变分析进一步明确了DAG三联体在蚜虫传播中的作用(Atreya等，1990：Gal．On等，1992)。CP与HC．Pro的互作在多种病毒中甚至在寄主植物中都已经得到了证实，CP的DAG基序与HC—Pro的KITC基序及PTK基序间的互作对蚜虫的传毒必不可少。该互作与“桥梁假说”一致‘(Dombrovsky等，2005：Jagadish等，1993Peng等，1998)。5 衣壳蛋白对烟草脉带花叶病毒侵染和致病力的影响2．4参与细胞间及系统移动系统侵染是指病毒经过胞间移动和通过韧皮部的长距离移动，从最初的侵染点运转到植物其他部位并建立侵染点的过程的过程(Carrington等，1996)。病毒的长距离移动包括从叶肉细胞开始，通过维管束鞘细胞、韧皮部薄壁细胞、伴胞细胞进入韧皮部筛管分子，在韧皮部随同化产物被动转移，最后在另一个部位建立新的侵染点。病毒是沿着光合产物转运的源．库途径进行转移的。从接种叶到韧皮部的转运速度比较慢，而到幼嫩分生组织的转运速度非常快(李向东等，2006)。。大多数植物病毒属病毒的这一过程需要一种或几种病毒编码的特异蛋白参与，这些蛋白称为移动蛋白(movementprotein，MP)。但potyviruses并不编码专门的移动蛋白，病毒的运动功能由其他几个蛋白行使，包括CP、HC．Pro、CI、VPg等。以前的研究证明CP、HC—Pro署1]VPg等蛋白与potyvimses的长距离移动有关(Carrington等，1998；Rojas等，1997)。将TEV中CP154位I拘Arg突变为Asp或者将198位I构Asp突变为心g，均能影响TEV在细胞间的移动，将CP的N．端缺失后，细胞间的移动变慢，而不能进行长距离移动(Dolja等，1994)。在蚜传中很重要的DAG保守基序对病毒的系统侵染也很重要，TEVCP中DAG第一个残基的改变(Arg或Lys)会使病毒粒子只局限于细胞间的运动而不能完成对烟草的系统侵染(Lopez．Moya等，1998)。CP的核心区与病毒RNA的包装有关，而N一末端和C．末端是病毒粒子在细胞间运动和系统运动所必需的。Dolja等用突变分析发现所有突变体在胞间移动和病毒粒子聚集过程中均为缺陷型，表明CP在potyviruses的移动中发挥了作用。TEVCP的N．端和C．端对病毒的系统移动必不可少，而中心区域对细胞间移动必不可少(Dolja等，1995；Dolja等，1994)。但是，Arazi研究发现，当删除或者用外源氨基酸替代ZYMVCPN．端的33个氨基酸，没有改变病毒的系统侵染(Arazi等，2001)。这个结果后来被Kimalov等证实，维持CPN端的净电荷为零对系统侵染是必需的，而不是基本序列(Kim“ov等，2004)。缺失N．端或C一端所引起的运动缺陷可以由转基因CP的表达而得到补偿，甚至其它属病毒的CP也可以补偿Potyvirus属病毒因CP突变而引起的运动缺陷，例如PVY和甜菜黄化病毒(Beetyellowsvirus，BYV)(长线形病毒属)的CP能够恢复马铃薯X病毒(Potatovirus兄PVX)CPc一术端缺失突变引起的系统运动缺陷，但是需要PVYCP和突变的PVXCP同时存在，而且CPC一末端以外的缺失所引起的不能系统运动就不能被其它potyvirusesfl向CP所补偿(Fedorkin等，2001；Fedorkin等，2000)。，。6 山东农业大学硕士学位论文病毒粒子在寄主植物中的系统运动与胞间连丝的体积排阻极[浸(sizeexclusionlimit，SEL)密切相关，可能需要Potyvirus属成员两个运动蛋白CP和HC．Pro的协调互作来增加SEL来促进病毒粒子在细胞间的运动，这个猜想在PVA、大豆普通花叶坏死病毒(Beancommonmosaicnecrosisvirus，BCM!、Ⅳ)以及莴苣花叶病毒(Lettucemosaicvirus，I．，MV)中都得到了验证(Andrejeva等，1999；Rojas等，1997)。对于HC．Pro$1]CP来说，蚜传和长距离运动这两种不同的过程有相似的需求，但蚜传缺陷型突变体仍具有长距离运动能力，说明HC．Pro矛I]CP相互作用形成有活性的复合物决定了蚜传和长距离运动的活性，但这种相互作用的性质对这两种过程来说是不同的(崔晓艳，2010)。．突变掉TEV的CP将改变它的细胞间移动而对其复制没影响(Carrington等，1998)。在TEV侵染的烟草中，CP的亚细胞定位在胞间连丝附近(Rodriguez—Cerezo等，1997)。CP作为运动蛋白，能够增加胞间连丝的穿透孔径，帮助病毒在细胞间移动(Rojas等，1997)。CP矛I]HC—Pron⋯匕够共同调解病毒的积累和运动(Andrejeva等，1999)。通过受侵染早期的组织超微结构研究，并借助特殊蛋白的免疫胶体金标记技术进一步证实CI蛋白和CP在胞间移动过程中发挥了作用(Roberts等，1998；Rodriguez．Cerezo等，1997)。CP总是在靠近胞间连丝开口处的质膜上。CI的中央和胞间连丝之间有～连续的通道，这一通道中含有CP，这种结构可能与病毒的胞间移动有关(宁金花等，2010)。病毒移动蛋白被寄主蛋白激酶磷酸化后能调控病毒的细胞间移动(Lee等，2001)。蛋白激酶CK2能使PVACP第242位的Thr发生磷酸化，该位点的突变影响病毒的胞间移动和长距离移动(Ivanov等，2003；Puustinen等，2002)。2．5影响病害症状的产生症状是寄主与病毒在细胞和超细胞水平上互作作用产生的。Potyviruses编码蛋白在症状诱导中准确的机制尚不明确。但是，编码蛋白和细胞膜的相关性可能导致症状产生，PVYCP被发现和叶绿体的类囊体膜相关(Gunasinghe等，1991)，因此，CP可能跟症状表达也密切相关。表达PVYCP的转基因烟草产生褪绿、花叶症状，与PVY侵染相似(Naderi等，1997)。TMV侵染烟草后，CP在叶绿体中的浓度与褪绿的严重度成正比(Reinero等，1989a)。所以，病毒的CP蛋白可能是破坏了叶绿体结构，使光合作用受到抑制(Culver，2002；Naderi等，1997)。其它属的病毒如烟草花叶病毒(Tobaccomosaicv护埘，TMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)的CP都在感病 衣壳蛋白对烟草脉带花叶病毒侵染和致病力的影响烟草的的叶绿体中发现，而且CP的积累量也与花叶症状严重度成正相关(Reinero等，1989b；朱水芳，1992)。在芜菁花叶病毒(Turnipmosaicvirus，TuMV)侵染的十字花科植物叶绿体中发现了有CP的积累，TuMV的CP可以与寄主植株叶绿体中的一种37kDa的蛋白发生互作，使叶绿体的光系统II(PSII)的光化学活性受到显著抑制，这种互作会影响植株症状的发生(付东亚，2004a；付东亚，2004b)。用PVY不同株系的NIb3，．末端、CP和3'-UTR区构建嵌合病毒，用粒子轰击实验发现它们的侵染性降低，在同一个寄主植物假酸浆(Nicandraphysaloides)。上PVY的不同株系会表现不同症状，所以推测同一病毒不同株系可能具有不一样的症状决定因子(Bukovinszki等，2007)。细菌双杂交体系发现PVY的CP和烟草的核酮糖．1，5．二磷酸羧化酶／力口氧酶(Ribulose-1，5一bisphosphateCarboxylase／oxygenase，Rubiseo)的大亚基(RubisCO—LSU)可以互作，这二者的互作可能参与PVY在烟草上的花叶和黄化症状(Feki等，2005)。3、反向遗传学技术在病毒蛋白功能研究中的应用反向遗传学是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰(如定点突变、基因插入／缺失、基因置换等)，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状的影响等方面的内容。与之相关的研究技术称为反向遗传学技术(范宝昌等，2001)。20世纪70年代出现的DNA重组技术使得在分子水平上分析和修饰基因组成为可能。病毒由于自身基因组小，结构简单，因而成为分子生物学的重要研究材料。但RNA病毒的分子生物学研究由于在复制过程中无DNA阶段受到阻碍，全长侵染性克隆在此时应运而生。将RNA病毒的基因组逆转录为互补的DNA(complementalDNA，eDNA)，然后插入到细菌质粒中进行复制，发现了一个非常振奋的现象——啥有全长eDNA的质粒具有侵染细菌的活性，并且能在其寄主细胞中完成复制循环。最初将这种技术应用到脊髓灰质炎病毒和类病毒上，取得了非常满意的效果(Cress等，1983；Racaniello，1984)。随后，花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosafcvirus，CaMV)35S启动子的发现并与全长侵染性克隆的结合让这种方法应用更为方便和广泛，用这种方法研究的第一种植物病毒是雀麦花叶病毒(Bromemosaicvirus，BMV)。目前构建的全长侵染性克隆有的携带 山东农业大学硕士学位论文T7启动子，需要在体外转录出具有侵染性的RNA用于接种植物；有的在上游引入CaMV的35S启动子，可以直接用质粒DNA接种植物，在寄主体内转录产生有侵染活性的病毒RNA。目前Potyvirus属成员全长侵染性克隆技术在基因功能研究方面的应用非常广泛，成为一个必不可少的技术。目前为止已经构建全长侵染性克隆的Potyvirus属病毒有TEV、TuMV、TVMV、PVY、PPV、ZYMV以及TVBMV等(Gal．On等，1995：Jakab等，1997：Lain等，1989；Lopez．MoyaandGarcia，2000：Nicolas等，1996：高瑞等，2011)。有了这些侵染性克隆，就可以根据生物学性状不同的病毒分离物的序列差异，或者针对高度保守的结构域构建一系列突变体，通过突变体的表现型来研究病毒基因的功能(Kasschau等，1998)。另一方面，如果能将报告基因(查I]GUS或GEP基因)克隆到侵．染性cDNA中，使其与病毒蛋白形成融合蛋白，或使其酶切后能释放出游离的报告蛋白，实时观察寄主植物体内的分布变化，就可以更方便的研究病毒基因的功能和在寄主体内的调控表达(杨彬等，2009；Saenz等，2000)。TEV侵染性克隆载体中插入GUS报告自：基因后证明CP参与病毒细胞间运动以及HC．Pro是长距离运动所必需的(Dolja等，j1994)。与此类似，利用GUS基因和GFP进行融合表达的试验得到了关于LMV细胞结-一：≈￡．构与病毒扩散之间关系的较为详尽的结果(German．Retana等，2000)。在病毒全长侵染性克隆的基础上进行病毒分离物间或不同病毒再重组，也就是用一种病毒功能片段的．：部分序列取代另外一种病毒的相应部位序列，构建嵌合病毒(chimericviruse)，可以确定病毒基因的功能(Hajimorad等，20081Johansen等，2001；Kelloniemi等，2008)。随着基因组序列测定技术的日渐成熟，反向遗传学技术的应用将越来越广泛。目前反向遗传学技术己广泛应用于生命科学研究的各个领域，且在病毒研究方面已经显示出了巨大的作用。本研究的目的是明确CP对TVBMV致病力和侵染能力的影响。材料与方法1实验材料1．1供试植物普通烟(Nicotianatabacum)NC89及本氏烟(Ⅳ．benthamiana)由实验室提供。9 农壳蛋白对烟草脉带花叶病毒侵染和致病力的影响1．2菌株和载体大肠杆菌菌株DH5a以及农杆菌GV3101由本实验室保存，pCaTVBMV—GFP侵染性克隆质粒、PVX-GRl06侵染性克隆质粒由实验室提供；pMDl8．T购自TaKaRa公司。1．3生化及分子生物学试剂RNaseInhibitor、dNTP、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、RNA反转录酶、无RNase的水等购自TaKaRa公司；DNA分子量标准DL2000plus、PCR产物回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自北京全式金公司；phusionDNA聚合酶购自thermer公司；DpnI，限制性内切酶购自NEB公司；其它生化及普通化学试剂均为进口或国产分析纯。1．4寡聚核苷酸引物本研究所有引物均由北京博尚生物公司合成。1．5实验所需试剂及配制1)LB培养基酵母粉5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，加水溶解后调pH7．0，定容至lL。若固体培养基则加1％琼脂粉。2)RNaseA．RNaseA溶解于0．01mol／LNaAC，使酶浓度为10mg／mL，加热至loo℃处理15．20min，慢慢冷却至室温，加入1／10体积1moI／LTris．HCl(pH7．4)，分装后于．20"C保存。．3)TE(pH8．0)10mmol／LTris—HCl(pH8．0)，1mmol／LEDTA(pH8．O)。4)EDTA(O．5mol／L，pH8．0)EDTA-Na‘2H20186．1g，加水溶解，用NaOH调pH8．O，定容至lL，高压灭菌。5)50xTAE缓冲液Tris242g，冰醋酸57．1mL，0．5mol／LEDTA(pH8．0)100mL，用水定容至1000mL，用时稀释50倍。2．实验方法2．1定点突变2．1．1突变位点的选择从NCBI上下载256个马铃薯Y病毒属病毒CP蛋白氨基酸序列进行比对，选择保守位点；将TVBMV．CP的氨基酸序列提交到I-TASSER网站进行cP蛋白结构分析，选择可能具有功能的关键位点，作为突变位点。10 山东农业大学硕士学位论文2．1．2突变体的设计原则对选定位点的亲疏水性及所带电荷种类进行分析，每个位点分别突变为三种不同的氨基酸：丙氨酸(立体空间小，侧链为无其他官能团的甲基，对蛋白的空间构型改变最小)；电性相反的氨基酸以及亲疏水性不同的氨基酸。2．1．3突变引物的设计2．1．4质粒DNA浓度和纯度的测定突变PCR对模板浓度和纯度的要求较高，通过分光光度计法对所得质粒的浓度和纯度进行测定。取适当稀释样品(20．50x)，测量其在260nnl和280眦下处的吸光值。质粒浓度可按下列公式算出：DNA浓度(p∥mL)=A260x50x(稀释倍数)。用A260与八280的比值可显示核酸的纯度，若其比值大于1．8，表示核酸浓度大于90％。将质粒稀释为10ng／pL，用于突变PCR。2．1．5突变PCR根据Liu等(2008)的方法，进行定点突变PCR。突变PCR体系：5xphusionBuffer10此，dNTP(10rnmol／L)1“L，F端引物1此，R端引物lpL，模板(pCaTVBMV—GFP质粒)o．5“L，PhusionDNAPolymerase0．2此，加ddH20至50止。突变PCR程序：94℃30s；94℃10s，Tmno(非重叠区域退火温度)20S，72℃12min，20个循环；94"C10s，Tmpp(引物互补区域退火温度)20s，72。C30rain；18。C保存。突变模板的DpnI消解：突变PCR结束后，在每一个反应体系中加入0．51．tLDpnI，充分混匀后，于37℃处理3小时。突变产物的沉淀：印门I消解后，每个反应体系中加入5pL3M醋酸钠(NaAC)溶液和250“L无水乙醇，．20"C沉淀过夜。将沉淀后的突变产物于12000rpm离心15min，倒掉上清，70％乙醇漂洗后置于室温，至自然干燥后加入10肛L的ddH20重悬。2．1．6大肠杆菌感受态DH5a细胞的制备采用CaCl2法制备新鲜的大肠杆菌DH5a感受态细胞，一切操作均在严格无菌环境下进行。1)用灭菌的量筒量取50mLLB培养基(不含抗生素)于250mL三角瓶中，各取1mL培养14．16h的菌液接种于上述三角瓶中，37"C，220—250r／min振荡培养3h。ll 衣壳蛋白对烟草脉带花叶病毒侵染和致病力的影响21将菌液倒入预冷的50mL离心管中，将离，tl,管放入冰上冷冻30min。3)菌液在4"C，5000r／rain，离心5min。小心地移去上清，将菌体重新悬浮于10mL冷的0．1MMgCl2(原体积的1／5)，4"C，5000r／rain，离心5rain。4)小心地移去上清，将菌体重新悬浮于25mL冷的O．1MCaCl2(原体积的1／2)，冰上放置20rain。5)4℃，5000r／min,离心5min。：·6)小心地移去上清，将菌体用5mL冷的O．1MCaCl2(原体积的1／10)重新悬浮悬浮物冰上放置12．14h后可直接用于转化，也可加入1mL无菌甘油，混匀后分装到1．5mL离心管于．80℃存贮备用。2．1．7突变产物转化大肠杆菌DH5a1)取1管感受态大肠杆菌DH5et感受态细胞置于冰上融化。加入10此突变产物，轻轻搅动lO次至均匀。2)将混合物于冰上放置30min，然后42℃水浴热激90s，冰上放置5min。3)加800gLLB(不含抗生素)，混匀；37。C，220r／min，培养45min。4)8000r／min，离心5min。吸出800此上清液，将剩下的200lxL菌液涂在含卡那霉素的LB培养基平板上，正放30rain，37℃倒置培养14．16h。2．1．8质粒的小量提取采用碱裂解法提取质粒DNA。溶液配制：溶液I：_葡萄糖50mmol／L，Tris—HCI(pH8．0)25mmol／L，EDTA(pH8．O)10mmol／L。高压湿热灭菌后贮存于4℃备用。溶液II：NaOH0．2mol／L，SDS1％。现配现用。溶液III．-．5mol／LKAC60mL，冰乙酸11．5mL，灭菌水28．5mL。保存于4℃的冰箱内。’提取步骤如下：1)挑取单菌落，接种于5mL灭菌的LB培养基(含卡那霉素)中，37℃振荡培养至对数生长期。2)12000r／min离心30s，收集2mL培养物中的菌体，尽量弃尽上清，．倒置片刻。3)加入200止溶液I，在涡旋器上使菌体充分重悬。12 山东农业大学硕士学位论文4)加入400肛L溶液II，立即将离心管缓缓颠倒数次直到溶液变清亮，冰浴2min。5)加入300此溶液Ⅲ，缓缓颠倒离心管数次直至白色沉淀充分形成，冰浴2min。6)12000r／min离心15rain，取上清转入另一微量离心管中，加入500皿异丙醇，混匀后于室温静置5min，12000r／min，离心10min使质粒DNA沉淀。7)弃尽上清，用200I．tL的TE溶解沉淀，之后加入200此冰预冷的LiCI溶液，冰浴5min后12000r／min，离心5min。8)转移上清到另一离心管中，加入800此无水乙醇，混匀后于室温静置5min，12000r／min，离心5min使质粒沉淀，弃去上清后用1mL70％F,醇洗涤沉淀，弃尽液体，用50此含liaNA酶A(20“∥mL)的TE溶解DNA沉淀。9)经1％琼脂糖电泳检测，以未突变的正常质粒pCaTVBMV．GFP为阳性对照。2．1．9序列测定将阳性克隆送北京博尚生物公司测序，测序结果利用DNAMAN软件进行序列比对，通过序列分析鉴定是否在设计位点处引入了目的突变。2．2农杆菌浸润本氏烟2．2．1农杆菌GV3101感受态细胞的制备采用改进CaCl2法。1)取．80℃冰箱中保存的农杆菌GV3101菌株，用移菌环蘸取菌液在LB平板培养基上划线，28。C培养直至长出茵落。2)挑取单菌落，接种于5mLLB培养液中，28℃摇24．36h。3)将活化的培养物1：50的比例接种到50mL新LB培养液中，28。C培养至对数生长期(约摇7h)。4)将菌液倒入预冷的50mL离心管中，冰上冷冻30min。5)菌液4。C，5000r／min，离心5min。6)小心地移去上清，将菌体重新悬浮于10mL冷的0．1MNaCl(原体积的1／5)。4。C，5000r／min，离心5rain。7)小心地移去上清，将菌体重新悬浮于25mL冷的0．1MCaCl2(原体积的1／2)，冰上放置20min。4℃，5000r／min，离心5min。8)小心地移去上清，将菌体用5mL冷的0．1MCaCl2(原体积的1／10)重新悬浮悬浮物冰上放置12．14h后可直接用于转化，也可加入1mL无菌甘油，混匀后装入小离心管于．80"C存贮备用。：·．．13 衣壳蛋白对烟草脉带花叶病毒侵染和致病力的影响2．2．2重组质粒转化农杆菌GV310l采用液氮冻融法。1)从．80"C冰箱中取出GV3101的感受态细胞100．200止冰上解冻，解冻后立即加入50一100ng已鉴定的质粒，冰上放置30rain。2)液氮中冷冻5rain，然后立即放入37℃水浴5min，冰上放置5rain。3)加入800此无抗生素的LB培养液，28。C摇床培养3h。4)5000r／min离心收集浓缩菌体，离心管中保留100．200此培养液并重悬菌体。5)将菌体均匀涂布于含相应抗生素(卡那霉素、利福平、四环素)的固体培养基平板上，放置30min后倒置，28'C温箱中培养48h直至出现菌落，挑取菌落进行菌落PCR鉴定。2．2．3菌落PCR鉴定在操作台中用牙签挑取单菌落，在已加入相应体积水的PCR管中轻转几圈作为模板，取出牙签在相应平板上点样复制，最后加其它PCR试剂。PCR扩增引物可用BbvcI．F(GClACAGAACCTCAGCATCGA)和HN39．9570．R2(GGGGTACCTATCCCGGGTTTTTTT，n[’TTTTTTTTTC)PCR扩增体系为IOxPCRBuffer2．5“L，dNTP(2．5mmol／L)2rtL，BbvcI—F1¨L；HN39．9570．R211．tL；TaqDNA聚合酶0．3皿，加ddH20至25此，用牙签挑取单菌落在PCR管中轻转几圈作为模板。+．‘PCR扩增程序：94℃3min；94℃50s，60℃50s，72℃1．5min，30个循环；72℃延伸10min；18℃保存。2．2．4农杆菌共浸润实验2．2．4．1母液的配制1)卡那霉素(Kan，50ms／mL)和四环素(Tc5mg／mL)：用水溶解，O．22I．tm过滤器过滤，分装20"C保存。2)利福霉素(Rift50mg／mL)：用DMSO配制，0．229,m有机系过滤器过滤，分装．20℃保存。3)乙酰丁香酮(AS，100mmol／L)：0．20g用DMSO充分溶解，O．22I．tm有机系过滤器过滤，分装．20℃保存。4)2-(N-吗啉)一乙基磺酸(MES，1mol／L)：用10mL水溶解2．13gMES，0．22},tm过滤器过滤，分装20℃保存。14 山东农业大学硕士学位论文2．2．4．2农杆菌注射接种1)将带有载体的农杆菌划线，28"C培养直至长出菌落。2)挑取单菌落，接种于5mL含有10mmol／LMES和20mmol／LAS及适当抗生素(四环素、卡那霉素和利福平)的LB培养基中，28。C摇24．36h。3)将活化的菌液按l：10(V／V)再接种到含有10mmol／LMES和20mmol／LAS及适当抗生素(四环素、卡那霉素和利福平)的LB培养基中，振荡培养至对数生长期。4)5000r／min，离心5min沉淀菌体，用10mmol／LMgCl2，10mmol／LMES和150mmol／LAS的重悬液重悬沉淀，调OD600至O．5左右，28"C静置3h。5)取lmL一次性注射器(去掉针头)吸取农杆菌重悬液后，选取5-6周龄4．6片真叶的本式烟，左手托住烟草叶片的正面，右手用针管顶住叶片的背面，用压力将菌液注入叶片的两个叶脉之间，每株注射两个叶片并使菌液扩散至整个叶片，对照用农杆菌菌体重悬溶液和含有空载体的重悬液注射。6)一周后每日观察症状，并进行血清学和分子生物学检测。2．3症状及致病力变化分析·2．3．1注射叶片及系统侵染叶片的RNA检测2．3．1．1植物总RNA的提取(TransZol方法)参照TransGen公司TransZol说明书1)取O．1g病叶于干热灭菌的研钵中，液氮研磨至粉末，迅速转移至2mLILNase．free离心管中，加1mLTransZol剧烈振荡，室温孵育5min。2)加200gL氯仿后剧烈振荡15s，室温孵育3min。314℃12000r／min离心15min。样品分为三层：无色的水相(上层)，中间层，粉红色有机相(下层)。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TransZol试剂的60％。4)转移无色的水相于新的1．5mLRNase．free离心管中，每使用1mLTransZol加入500IxL冰冻异丙醇，室温孵育10min。5)4。C、12000r／min离心10min，在管侧和管底形成胶状沉淀。6)弃上清，用1mL75％乙醇(DEPC处理的水混制)洗涤沉淀。每lmLTRIzol至少加lmL75％乙醇。7)4℃，7500r／min离心5min。8)弃上清，室温干燥5min，沉淀溶于50—100pLRNA溶解液(保存于4。C)。55．60"C孵育10min，保存样品于．80℃以备长期使用。 衣壳蛋白对烟草脉带花叶病毒侵染和致病力的影响2．3．1．2RNA基因组DNA的去除1)在微量离心管中配置下列反应液：全RNA20-50嵋，10xDnaseIbuffer5此，DnaseI(Rnase—free，5U／}tL)2pL，RnaseInhibitor(5U／rtL)O．5pL，加DEPC处理的H20至50斗Lo2)37℃反应20--一30分钟。3)热处理使DNaseI失活：加入2．5pLO．5MEDTA80℃2min，用Rnase．freeH20定容至100p,L。4)加入10此3M醋酸钠，250止冷乙醇，冰上放置10min。5)4"C，13500rpm离心15rain，弃上清。6)加入70％冷乙醇洗净，4"C，13500rpm离心5rain，弃上清。沉淀干燥。7)用适量的Rnase—freeH20溶解后，进行Agarose电泳确认是否除去基因组DNA．2．3．1．3反转录PCR1)反转录体系：植物总RNA8gL，5×RTbuffer4gL，dNTP(10mmol／Leach)1pL，弓J物．R(10gmol／L)1gL，RNAFreeH204．5“L，ES-RT(200U／gL)1gL，RNaseinhibitor(40u／-tL)0．5gL。反转录程序：42℃50min，70。C15rain终止反应后置于--20℃保存。2)PCR体系：10×buffer(．M矿)2,59L，M矿(1．5mmol／L)1．59L，dNTP(o．2mmolfL)2,09L，引物一R1．0p,L，BbvcI—F1．09L，HN39-9570一R21．09L，DNA多聚酶(rYaq)0．39L，加ddH20水至25“L，混匀，离心。PCR程序同2．2．3。3)PCR产物的电泳检测PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。2．3．2ELISA检测2．3．2．1试剂配制1)抗原包被缓冲液(O．05mol／L碳酸盐缓冲液，pH9．6，1000mL)NazC031．59g，NaHC032．93g，蒸馏水定容至1L，4"C保存。2)洗涤缓冲液(O．02mol／LPBST，pH7．4，1L)，NaCI8．．0g；NazHP04‘12H202．9g，KH2P040．2g，KCl0．2g，Tween．200．5mL，蒸馏水定容至1L，4。C保存。3)封闭缓冲液(PBST+5％脱脂奶粉)脱脂奶粉O．5g，加10mLPBST溶解。16 山东农业大学硕士学位论文4)碱性磷酸酯酶底物缓冲液(pH9．8，100mL)二乙醇胺10mL，用浓HCl调pH至9．8，蒸馏水定容至100mL。4"C保存。5)底物溶液：用前10min内配制，将pNPP(对硝基磷酸苯酯)用碱性磷酸酯酶底物缓冲液稀释成1me,／mL的溶液。2．3．2．2间接ELISA操作步骤4r丫Y霎嚣厂一YEYE霎嚣：jjii底物一蝥剀鳖幽竺竺蛐兰删竺p抗原制各：鲜样按照1：10的比例(干样1：100)加入抗原包被缓冲液，用湿热灭菌的研钵充分研磨，6000r／min3min。取上清备用。加样设计：提前在相应表格上设计好加样顺序，空出边缘的孔以防止边缘效应，每个样品三个重复(包括空白对照和阴性对照即健康样品对照)，阳胜对照的加入可以检验试验的准确性。1)包被酶联板：除空白孔(加抗原包被缓冲液)，每孔加150p,L相应抗原包被酶联板。酶联板加盖，4℃孵育过夜(酶联板的底部保持干净以防影响读数)。2)洗板：将酶联板迅速反扣，弃去孔中液体，每孔加入PBST液约200肚，静置3—5min后迅速弃去孔中液体，并在吸水纸上扣打几下以尽量除去孔中液体，如此重复3次。3)封闭：每孔加入150此的封闭缓冲液，37。C恒温箱孵育1．5h。4)洗板：同步骤2。5)加一抗：用PBST稀释特异抗体(来源于兔)至合适的工作浓度(1：200)，每孔样品加150gL，37℃恒温箱孵育2h。6)洗板，同步骤2。7)加酶标抗体：每gLJJn2＼I150此PBST稀释的碱性磷酸酯酶标记的鼠抗兔(1：50000)，37。C恒温箱孵育2h。8)洗板：同步骤2。 衣壳蛋白对烟草脉带花叶病毒侵染和致病力的影响9)显色：每孔加底物溶液150pL；室温避光显色30．60min；酶联仪在405nm下读数。’I／H23判断为阳性反应。其中I=待测样品OD值一空白OD值，H=阴性样品OD值一空白OD值。2．3．3WesternBlot分析2．3．3．1试齐4配制1)琼脂糖凝胶(1％)称取琼脂0．39，加入30mL去离子水，溶化后备用。2)10％过硫酸铵(O．5mL)称取0．059过硫酸铵于1．5mL离心管中，iJn3,0．5mL灭菌水，混匀，置于4"C备用。．．3)30％丙烯酰胺(100mL)称取29g丙烯酰胺，lgN，N·亚甲双丙烯酰胺，溶于总体积为60mL的水中，37。C溶解，定容至100mL，用孔径O．45此的滤器过滤除菌，置于棕色瓶中4"C保存。4)10％SDS称取固体SDS10g，加去离子水68"C搅拌至溶解，定容至100mL。5)1．5mol／LTris—HCl(pH8．8)(200mL)称取固体TrisBase36．3429，加入约150mL去离子水溶解，HCl调pH至0．8，定容至200mL。6)1．Omol／LTris—HCI(pH6．8)称取固体TrisBase24．228g，加入约150mL去离子水溶解，HCl调pH至6．8，定容至200mL。7)5×甘氨酸(1L)"Iris15．19(O．125mol／L)，甘氨酸72．Og(O．96mol／L)，固体SDS5．09(0．5％)，去离子水定容至lL，使用前用去离子水稀释至1X电泳缓冲液．。8)2xSDS上样缓冲液SDS500mg，巯基乙醇1mL，甘油3mL，溴酚兰4mg，1mogL(pH6．8)Tri-HCl2mL，蒸馏水定溶至10mL。9)转移缓冲液(800mL)“s．HCl0．97g，甘氨酸5．97g，甲醇80mL，去离子水走容至800mL，4度预冷。lR 山东农业大学硕士学位论文10)TBST(1L)20mmol／LTris—HCl(pH7．5)2．423g，150mmol／LNaCl8．766g，0．05％Tween一20，蒸馏水定溶至1L。11)封闭液TBST+5％脱脂奶粉。12)BCIP(5。溴．4．氯。3．吲哚磷酸)BCIP0．5g，100％二甲基甲酰胺10mL。13)碱性磷酸脂酶底物显色缓冲液(100mL)10mmol／L‘Tris—HCl(pH9．5)0．121g，10mmol／LNaClO．058g，O．5mmol／LMgCl2O．0102g，蒸馏水定溶至100mL。14)植物总蛋白提取缓冲液1mol／LTris．HCl(pH8．O)10mL(100mmol／L)，D一巯基乙醇70p,L(10mmol／L)，蔗糖6．8469(O．2M)，去离子水定容至100mL，室温保存。15)NBT(氮蓝四唑)10mL70％二甲基甲酰胺(用水稀释至70％)溶解0．5gNBT。2．3．3．2植物总蛋白样品的制备1)选取生长旺盛的植株叶片，用自来水冲洗干净，除去表面尘土，再用蒸馏水冲洗，吸干表面水分。．-，2)称取19叶片，加入2mL蛋白提取液进行研磨至匀浆，研磨后分装至2个1．5mL的离心管中。(研钵提前置于．20℃预冷)3)4"C，12000rpm离心15min，取上清。4)取适量提取的植物总蛋白，加入等体积的2xSDS上样缓冲液，沸水煮5min，立即放入．20℃冰箱，．5min。5)12000rpm离心10min，取上清用于SDS—PAGE电泳。2．3．3．3SDS．PAGE蛋白电泳分离胶的制备(12％，10mL)：灭菌水3．3mL，30％丙烯酰胺液4．0mL，1．5mol／LTris．HCI(pH8．8)2．5mL，10％SDSO．1mL，10％过硫酸铵0．1mL，TEMED0．004mL。浓缩胶的制备(5％，6mL)：灭菌水4．1mL，30％丙烯酰胺液1．0mL，1．0mol／LTris．HCl(pH6．8)O．75mL，10％SDSO．06mL，10％过硫酸铵O．06mL，TEMEDO．006mL。，19 衣壳蛋白对烟草脉带花叶病毒侵染和致病力的影响加样：根据样品浓度及凝胶孔的大小，点样体积一般35-5099。加样时将微量进样器的针头穿过凝胶孔上的缓冲液，使样品缓缓落在凝胶面上。电泳：将电泳槽与电泳仪相连后，上槽为负极，下槽为正极。打开电源开关，可稳压100V电泳至溴酚蓝到达分离胶底部(离下端大约lcm)时停止电泳，关闭电源。电泳时间和电压大小要根据目的带大小进行调整。电泳结束后卸下玻璃板，用刀片撬开玻璃板，用洗瓶将凝胶从玻璃板上慢慢冲下于盛有少量去离子水的大培养皿中，用于Westernblot。2-3．3．4Westernblot实验步骤(一)转膜1)将海绵垫浸入转移缓冲液中。2)切6张灭菌滤纸和一张NC膜，大小与胶一致，用软铅笔在滤膜一角上做好标记或同时切去凝胶、滤纸NC膜的一角作为标记。3)将NC膜漂浮在去离子水上，浸泡5rain以驱除滤膜上的气泡。4)将4张3mm滤纸浸泡于转移缓冲液中(少量即可)。5)安装转移装置(负极向正极转)。A．平放底部电极(阴极)，放上一张海绵垫；B．在这一电极上放置2张3mm滤纸，逐张放，并用玻璃棒挤驱气泡；C．放胶(去离子水冲洗一下)，标记左下角，驱气泡；D．放NC膜，避免气泡，放上～张滤纸后驱赶气泡；E．逐张放滤纸，对齐，驱气泡，放上另一张海绵垫。6)阳极接于底部电极，接通电源，电压100V，转移1—1．5h。(二)封闭将NC膜用去离子水冲洗一下，放入封闭液，室温下于水平摇床封闭1—1．5h或4"C封闭过夜。(三)加入一抗在封闭液中加入一抗抗血清(1：200)，室温摇床上温育1～1．5h后，倒掉脱脂奶粉，用TBST冲洗一下，然后10．15mLTBST洗膜3次，每次10min。(四)加入二抗加入TBST稀释50000倍的碱性磷酸酯酶标记的鼠抗兔，室温孵育l～1．5h。用TB3T洗膜3次，每次10rain。20 山东农业大学硕士学位论文(五)显色膜用水和碱性磷酸酯酶缓冲液分别洗一下，15mL碱性磷酸酯酶的缓冲液中加入75微升NBT、37．5微升BCIP混匀，避光显色2．10min，用水冲洗结束反应。2．4突变蛋白二级结构分析将突变蛋白的氨基酸序列提交到PoleBioinformatiqueLyonnais网站的SecondaryStructurePrediction中的NPS@数据库中进行SOPMA二级结构预测，得到数据后，进行氨基酸的二级结构比对。2l 衣壳蛋白对烟草脉带花叶病毒侵染和致病力的影响结果与分析：口7K—=J7J17l1．具有功能关键位点的初步筛选1．1突变位点的选择及突变引物的设计根据序列比对，筛选出3个马铃薯Y病毒属病毒CP蛋白中的保守位点：Trpl22、Ar9192、Lys225；又通过蛋白分析，选择了set92位点，进行突变，突变方式：Ser92分别突变为Ala92、Asp92和His92；Tipl22分别突变为Alal22、GIul22和Lysl22；Ar9192分别突变为Alal92、Cysl92和Glul92；Lys225分别突变为Ala225、Cys225以及Glu225。 山东农业大学硕士学位论文1020·⋯I·．．·I····I⋯·l一一一一一一一SGTC,QPQpPIVDA⋯⋯⋯一⋯⋯一VDA一一一一一一一一一一1他GGDDD、，T⋯⋯⋯一⋯⋯⋯G一一一一一一一一⋯一一⋯一ANDSGTVDAnAQGGGSGSGTTppSGTVDA!；AQGGGSGs6TTPPSGTVDAGAQGGGSGSGTTpp一一⋯～一SDT—QTR一一一一弘⋯⋯一⋯一一⋯GDN—Q80····I·．．·f90．-．．1···-l一一一⋯一I犯一一一一一一一pKDPFSYGVIGNQ一一⋯·一r二lU‘⋯⋯一GSN一一一一一一一GSN一一一⋯一GSN一一一⋯一KDV·一⋯一一G1峨30·⋯I⋯·IGVDAj；KDK—一KLDA∞W．S一一LVDAjKSTITT工DA广；ET⋯TIDA粥SS一一ATGSGTGTRTA1f；s{jlr；tRxATnSGTCTRTGA(；ASKKD—一TVD^J：，K一⋯40．⋯l⋯·IPSTGTPA4X／NPSTtjlPA口；NPSTGTPAQG甜SO60．．．·I．⋯I⋯·I⋯·l一一一一一一RERNNR0l哐PE一一一⋯⋯KTDD—让NSAD一一·SQFPPPPFPNLQSTAPMFNP一一一一一一一一一一一PAQ]鸪E一一一一一一一一一黑KDARPE∞S一一一一TppASGr；SsGNNoGGQS—TPPASf；_E；-SSGNNr；Gt；QS⋯rpPAs∽ssG瑚GGr；QS一一一一一一一KDED一一一KDKK一一一⋯⋯一一一N】LQSNQKQ⋯70⋯·l⋯·IIFTPATTQPN100110120130140⋯．I⋯．1⋯·l⋯．1⋯．I⋯·I⋯．I⋯·l⋯·I⋯·IGSGNNS鼬AGDS翱如如VN^GSKGK-VVPRLQKITKR删LPMVKGI叮VILNIVTEKI；sSSr_硷MKKDDDINAGLH，jKHTIPRTKAITQl4MKLpMIR’矗订^ALNVTPSSS}“也ⅥJTRKDRDVDAGTl0TPSVPR工J0蜀l曩TSl江SLPKVRjKAIMK&1Ef；NSj，KAVA一、，KDRDVDI』；TA“THSVpRIKSM!TSKLTLpM匝．K求SVV⋯IQSNP婀0G⋯KDKDVNA(；TSGTHTVPRlKSITSKMRMPKSK]ATl珏GTC／；_Q2LGSSGA甜蝈BDKDVDAGSToKlgVPKI．KAMSKKMRLPKAK’；KDVLC疆u尬AGSSGA∽硷RDl∞、，D』珏STI二；KISVPKUU帆slU呱LPKAK，jKDVLGTf■；QAfsSSGAC4垃：RDKDVDAGSTrjKISVPKI．KAMSKKMRLPKAK7；KDVLASSSASElU、VATATKDKDVNAGSH—jK—IVPRLSKITKKMSLPRVKUSVILQVGNTSS(册KD一一KDKDVNVGTSGTFSIPRI丑GLSTKINLpRIKGlU孙，V150I‘口170180I叠口2002I口⋯．1⋯．I⋯．I⋯·I⋯．I⋯．1⋯·I⋯·I⋯．I⋯·l⋯．f⋯．1⋯．I⋯·INLDHL工DYKpEoTDLPNTR^TKMQPEMWYN^：订矿；EYElDDAO陋lVlql中3F●lVWCIDNGTSPDVNGTWVMMNLDH工．LEYEPNQRDl5NTRATO阴％QYEsm(刃KNDYDVDDSc羽l口LIL帕LMVwCIENGTSPNINfjTNVHMNLHHLAHYNPAQTDLSNTRAPIQSCFQTWYEGVl‘RDYDVsDDEMSIILNuLMVWCIENuTSPNINr净西n榭NLDHLLSYKPKQVDLSNARATHEQrQNwYDGVKAsYELEESsM旺IILNoF■ⅣwCIENl)TsPDlNjVwTMMNLE川【．LEYAPQQIDISNTRATQSQPDr●“EA们狮AYDIIjE硼卦彻，MNGLMVWCIENGTSPNvN{jV●订，MMHIDFLLTYKPQQQDISNTRAT砬EFDRwYDAIKKEYEIDDTQMX弋F％'MS；LMVWCIENf刀sPNlN·圳唧嘲HLDF．LLTYKpQQQDlSNTRATKEEFDR舳AIK弛YEIDDTQMTVVMS．'；LMVWCIENc；CSPNIN|=；NW删HLDF’LLTYKPQQQDIsNTRAT]眺PDR，彻Al●吐啦YElDDTQMTVVMSjLMVWCIEN(圮SP"IN，jNwTMMDIDHLIEYKPDQIELYN棘ASHQQFASWFNQVKAEYDIJ屺QQM二V■，I噜0PMVWCIENGTSpDINj^nnn口lN]SQHLLEYTPD口VSLSNTRALNSQF?AS眦L,％rKUDYDzDD^a吧IⅥ件÷LMVWCIE冲iTSPNLNl暑啪VHM▲■2202302402502鼬270280．⋯l⋯．I⋯．I⋯．f⋯．I⋯．I⋯．I⋯-I⋯．I⋯．1⋯．I⋯．1⋯．I⋯·IDGDEQⅦYPLKP，ⅣENAKPT璩QIMHHPSDAAEAJIEH哦NSEKPnⅡ’R工GIIRNIRDKNLARYAFDFYE、rDCEEQVEYALKPIIEHAKPTFRQIM融HFSDAA队YIEH喊NKKKPYHpR!Gmr；工削DMG,LARYArDFYETD(，ETQVEYPIF,PLLDHAKPTrRQI劓【AHPSNVAEAYIEKRNI"EKAYMPR工GIQRNLTDYSLAR簟AFDFYl卦IDDEEQVSYPLKP量旺DHAKpSLRQIN田【HrSA工J哇塘YIE-tRSREKPY●旺1HGL0疆UamDQSLARYAPDFYEIDbDEQVEYPLKPIVENAKPTLRQIMmlFSDVAEAYIEⅪtNKKEP日o’RXGLIR24T_．RDVoLAR。YAFDFYEVDGDEQRVFPLKPVIENAsPTFROI姗HPSDAA队YIEYRNSTER硼MPRYGLQ．RNLTDYSLAR了ArDFYEMDGDEQRVFPLKPVIENASPTrRQIMHHFSDAA队YIEYRNS卫即UD口RYGLQRNLTDYsLARY肿F删DGDEQRvrpLKPV!ENASpT陬QIMHHPSDAAEAYIEYRNSTERYloRYGLQRHLTDYSLARYAFDFYEMDGNEQWEYPLKPIv】巳}4AKPTI丑QIMHHFsDAAEAYIEMRNAEAPn口RYGL工丑NLRDRSLARYAF．DFYEVDGDBQ睨YPIKPLLEHAKPTF蛋QImHFSNI．AEAYIEKRNA啪舯RYGLQR'rL翻∞舶1ARYArDFYEl▲290300310320330340．⋯I⋯．1⋯．1⋯．I⋯．1⋯．1⋯·I⋯·I⋯．I⋯·I⋯·I⋯·I⋯TSKTSDRARE^飞陷a，供A曩^IS奈ⅣssKLrGLDr荆V矗TTSENTERHTARDVNQ舢TIzr善盯SpQTSATPKRAREAHN(净傅AAAIVOTQNRLF