烟草脉带花叶病毒和马铃薯a病毒hc-pro调控rna沉默抑制、协生和致病力的机制

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1、山东农业大学博士学位论文烟草脉带花叶病毒和马铃薯A病毒HC--Pro调控RNA沉默抑制、协生和致病力的机制姓名：王洁申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：李向东20120611山东农业大学博：}：学位论文中文摘要马铃薯Y病毒属病毒编码的辅助成分．蛋白酶(Helpercomponent．proteinase，lIC—Pro)是一种多功能蛋白，参与病毒的蚜传、症状表达、基因组复制、移动、抑制RNA沉默，以及与其他属病毒的协生等过程。本文利用不同体系分析了烟草脉带花叶痫群(7bbaccoveinbandingmosai

2、cvirus，TVBMV)和马铃薯A病毒(PotatovirusA，PVA)l—IC．Pro不同突变对RNA沉默抑制、协生活性和致病力的影响，明确马铃薯Y病础属病毒HC．Pro调控这些过程的机制，为利用弱毒株系防治TVBMV提供物质基础和础沦指导。本研究主要研究结果如下：构建了包含pCaGFP、pCahpGFP和pCaHC(含有TVBMVHC—Pro基因)三个载体的RNA沉默抑制瞬时表达分析体系，并利用此体系比较了TVBMVHC．Pro野生型和18个突变体的抑制RNA沉默活性，这些突变体抑制RNA沉默的活性分为四类：(

3、1)5个突变体抑制RNA沉默活性升高；(2)5个突变体抑制RNA沉默活性不变；(3)2个突变体抑制RNA沉默活性降低；(4)6个突变体丧失了抑制RNA沉默活性。用抑制RNA衫C默活性强的突变体浸润本氏烟叶片中GFP蛋白的表达量更大，而用抑制RNAj!『C默活性挺失的突变体浸润的本氏烟叶片中检测不到GFP蛋白的表达。利用pAGFP、pAhpGFP和pAHC(含有PVAHC-Pro基因)三个载体构成的瞬时农达体系研究了PVAHC．Pro突变对其抑制RNA沉默活性的影响。结果表明，9个突变休的抑制RNA沉默活性降低，另外9个

4、突变体丧失了抑制RNA沉默活性。相同的突变对TVBMV和PVA两种病毒HC．Pro抑制RNA沉默活性的影响不同，如TVBMVlIC．Pro突变体D198A抑制RNA沉默活性降低，而PVAHC．Pro相同突变体丧失了抑制RNA沉默活性。第6位保守氨基酸F缺失后，PVAHC．Pro抑制RNA沉默活性降低，Iflf，1’V13MVHC．Pro抑制RNA沉默活性丧失。携带野生型HC．Pro的马铃薯X病毒(PotatovirusZPVX)侵染性克隆接种本氏炽I后引起{!I．f株的系统坏死。利用PVX载体研究了TVBMV和PVAH

5、C—Pro突变对协生作J11的jI够I礼’FVBMVHC．Pro的6个突变体在本氏烟上不引起坏死症状，另外12个突变体oJ野生型IIC．Pro一样在本氏烟上引起坏死症状。TVBMVHC．Pro丧失抑制RNA杉C：

6、扶活性的突变都同时世失了协生作用，表明TVBMVHC．Pro这两种功能间具有相关性。PVAHC．Pro的11个突变体失去了协生功能，其中、9个突变体丧失了抑制RNA沉默沂性，2个突变体抑制RNA沉默活性降低。烟革脉带化叶病毒和马铃薯A病毒HC．Pro调控RNA沉默抑制、协生和致炳力的机制利用携带GFP的TVB

7、MV侵染性克隆pCaTVBMV-GFP测定了HC．Pro17个突变对‘I’VBMV致病力的影响。野生型pCaTVBMV-GFP在本氏烟上能够引起脉明、花叶、畸形和械株矮化等症状，在紫外灯下表现出明显的绿色荧光。突变体EITC、AGS和SQN表现脉明及叶片畸形症状，与野生型TVBMV症状一致，说明这些位点的突变对病毒的致病力无影响。突变体PAK、D198Y、D198F和D198G在接种后第8天症状表现轻微f门脉明，但后期症状与野生型病毒相似，说明这些位点的突变延迟了症状的产生。突变体APS、D198H、D198R、D19

8、8K、FINK、F6Del、D198A、DEN、IQI和ART接种的{!lJ【株初期仅表现脉明症状。紫外灯下观察发现，症状明显的植株都表现出较明显的绿色荧光，而症状变轻的突变体中，D198R初期荧光强度与野生型病毒一致，其余突变体仪染植株均表现较微弱的绿色荧光。抑制RNA沉默丧失的6个突变体致病力都减弱，酏I刃I·IC．Pro抑制RNA沉默活性与病毒致病力之间存在相关性。关键词：烟草脉带花叶病毒；马铃薯A病毒：HC．Pro：定点突变；抑制RNA沉默；协生作用：致病力：农杆菌共浸润：马铃薯Y病毒属2山东农业大学博：J：学

9、位论文MechanismoftobaccoveinbandingmosaicvirusandpotatovirusAHC—ProregulatingRNAsilencingsuppression，synergismandvirulenceAbstractThchclpercomponent-proteinase(HC-Pro)en