《烟草脉带花叶病毒和马铃薯a病毒hc-pro调控rna沉默抑制、协生和致病力的机制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
山东农业大学博士学位论文烟草脉带花叶病毒和马铃薯A病毒HC--Pro调控RNA沉默抑制、协生和致病力的机制姓名：王洁申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：李向东20120611 山东农业大学博：}：学位论文中文摘要马铃薯Y病毒属病毒编码的辅助成分．蛋白酶(Helpercomponent．proteinase，lIC—Pro)是一种多功能蛋白，参与病毒的蚜传、症状表达、基因组复制、移动、抑制RNA沉默，以及与其他属病毒的协生等过程。本文利用不同体系分析了烟草脉带花叶痫群(7bbaccoveinbandingmosaicvirus，TVBMV)和马铃薯A病毒(PotatovirusA，PVA)l—IC．Pro不同突变对RNA沉默抑制、协生活性和致病力的影响，明确马铃薯Y病础属病毒HC．Pro调控这些过程的机制，为利用弱毒株系防治TVBMV提供物质基础和础沦指导。本研究主要研究结果如下：构建了包含pCaGFP、pCahpGFP和pCaHC(含有TVBMVHC—Pro基因)三个载体的RNA沉默抑制瞬时表达分析体系，并利用此体系比较了TVBMVHC．Pro野生型和18个突变体的抑制RNA沉默活性，这些突变体抑制RNA沉默的活性分为四类：(1)5个突变体抑制RNA沉默活性升高；(2)5个突变体抑制RNA沉默活性不变；(3)2个突变体抑制RNA沉默活性降低；(4)6个突变体丧失了抑制RNA沉默活性。用抑制RNA衫C默活性强的突变体浸润本氏烟叶片中GFP蛋白的表达量更大，而用抑制RNAj!『C默活性挺失的突变体浸润的本氏烟叶片中检测不到GFP蛋白的表达。利用pAGFP、pAhpGFP和pAHC(含有PVAHC-Pro基因)三个载体构成的瞬时农达体系研究了PVAHC．Pro突变对其抑制RNA沉默活性的影响。结果表明，9个突变休的抑制RNA沉默活性降低，另外9个突变体丧失了抑制RNA沉默活性。相同的突变对TVBMV和PVA两种病毒HC．Pro抑制RNA沉默活性的影响不同，如TVBMVlIC．Pro突变体D198A抑制RNA沉默活性降低，而PVAHC．Pro相同突变体丧失了抑制RNA沉默活性。第6位保守氨基酸F缺失后，PVAHC．Pro抑制RNA沉默活性降低，Iflf，1’V13MVHC．Pro抑制RNA沉默活性丧失。携带野生型HC．Pro的马铃薯X病毒(PotatovirusZPVX)侵染性克隆接种本氏炽I后引起{!I．f株的系统坏死。利用PVX载体研究了TVBMV和PVAHC—Pro突变对协生作J11的jI够I礼’FVBMVHC．Pro的6个突变体在本氏烟上不引起坏死症状，另外12个突变体oJ野生型IIC．Pro一样在本氏烟上引起坏死症状。TVBMVHC．Pro丧失抑制RNA杉C：|扶活性的突变都同时世失了协生作用，表明TVBMVHC．Pro这两种功能间具有相关性。PVAHC．Pro的11个突变体失去了协生功能，其中、9个突变体丧失了抑制RNA沉默沂性，2个突变体抑制RNA沉默活性降低。 烟革脉带化叶病毒和马铃薯A病毒HC．Pro调控RNA沉默抑制、协生和致炳力的机制利用携带GFP的TVBMV侵染性克隆pCaTVBMV-GFP测定了HC．Pro17个突变对‘I’VBMV致病力的影响。野生型pCaTVBMV-GFP在本氏烟上能够引起脉明、花叶、畸形和械株矮化等症状，在紫外灯下表现出明显的绿色荧光。突变体EITC、AGS和SQN表现脉明及叶片畸形症状，与野生型TVBMV症状一致，说明这些位点的突变对病毒的致病力无影响。突变体PAK、D198Y、D198F和D198G在接种后第8天症状表现轻微f门脉明，但后期症状与野生型病毒相似，说明这些位点的突变延迟了症状的产生。突变体APS、D198H、D198R、D198K、FINK、F6Del、D198A、DEN、IQI和ART接种的{!lJ【株初期仅表现脉明症状。紫外灯下观察发现，症状明显的植株都表现出较明显的绿色荧光，而症状变轻的突变体中，D198R初期荧光强度与野生型病毒一致，其余突变体仪染植株均表现较微弱的绿色荧光。抑制RNA沉默丧失的6个突变体致病力都减弱，酏I刃I·IC．Pro抑制RNA沉默活性与病毒致病力之间存在相关性。关键词：烟草脉带花叶病毒；马铃薯A病毒：HC．Pro：定点突变；抑制RNA沉默；协生作用：致病力：农杆菌共浸润：马铃薯Y病毒属2 山东农业大学博：J：学位论文MechanismoftobaccoveinbandingmosaicvirusandpotatovirusAHC—ProregulatingRNAsilencingsuppression，synergismandvirulenceAbstractThchclpercomponent-proteinase(HC-Pro)encodedbypotyvirusesisamultifunctionalproteininvolvedinmanyprocessesinlifecycle，includinggenomeamplification，movement，symptomexpression，aphidtransmission，RNAsilencingsuppressionandsynergismwithvirusesofothergenus．Inthepresentstudy，weanalyzedtheeffectsofdifferentmutantsofpotatovirusA(PVA)andtobaccoveinbandingmosaicvirus(TVBMV)HC．ProontheactivitiesofRNAsilencingsuppression(RSS)，synergism，andvirulence．Themainresultsreadasfollows．WcfirstconstructedatransientassaysystemforRNAsilencingsuppressionthatincludesthreevectors，pCaGFP,pCahpGFPandpCaHC(carryingTVBMVHC．Progene)．Withthissystem，wedeterminedtheactivitiesofwildtypeand18mutantsonRSS．TheRSSactivitiesofTVBMVHC—Promutantswereclassifiedintofourcategories：(1)Fivemutantsshowcdincreasedactivity；(2)FivemutantsshowedsimilarRSSactivitywithwildtype1IC·pro；(3)Twoshowedreducedactivity；(4)SixlostRSSactivitycompletely．MoreGFPWaSdctcctcdinNicotianabenthamianaleafpatchesagroinfiltratedTVBMVHC—PromutantsthatshowedstrongerRSSactivity．ThereisnoGFPdetectedinⅣbenthamianaleafpatchesagoinfiltratedTVBMVHC-PromutantsthatlosttheirRSSactivity．1’hcRSSactivitiesofwildtypeand18mutantsofPVAHC—Prowerecomparedusingthreevectors，pAGFP,pAhpGFPandpAHC(carryingPVAHC．Progene)．TheresultsshowedthatninemutantsshowedreducedRSSactivities，andtheotherninemutantslosttheirRSSactivities．SamemutationmayshowdifferenteffectsonRSSactivityindifferentviruses．Forexamples，themutationD198ApartiallyreducedtheRSSactivityofTVBMV1IC-Pro，butabolishedthatofPVAHC-Pro；F6DelreducedtheRSSactivityofPVAHC．Pro，butabolishedthatofTVBMVHC—Pro．RecombinantPVXvectorscarryingTVBMVandPVAHC．Progenewillresultin 烟华：脉带花叶稍毒和马铃薯A病毒HC．Pro调控RNA沉默抑制、协生和致病力的机制systemicnecrosisofⅣbenthamianaplants．ThesamemutationsofTVBMVandPVA1IC—Progenewereanalyzedfortheirsynergismactivity．TwelvemutantsofTVBMVHC—Proresultedinsystemicnecrosisasthewildtypeone，whileothersixmutantsjustinducedmosaic．’l'hemutationsinTVBMVHC—ProgenethatabolishedRSSactivityalsolostthesynergismactivity,indicatingtheassociationbetweenthesetwofunctions．ElevenPVA1IC一1’romutantslosttheirsynergismactivity,amongwhichninelosttheirRSSactivityandtwoshowedreducedRSSactivity．Theeffectsofl7TVBMVHC—PromutantsonthevirulenceofTVBMVwereanalyzedwithpCaTVBMV-GFP,aninfectiousclonecarryingJpgene．AswildtypepCaTVBMV-GFP,mutantsEI'I’C，AGSandSQNinducedveinclearing，mosaicandmalformationinⅣbenlhamianaplants，implyingthatthesemutationshadnoeffectonvirulenceofTVBMV．MutantsAPS，PAK，DI98YD198FandD198Gshowedslightveinclearing8dpiandsimilarsymptomaSwildtypeviruslater,implyingthatthesemutationsjustdelayedthesymptomexpression．MutantsD198H，D198R，D198K，FINK，F6Del，D198A，DEN，IQIandARTinducedslightsymptomonN．benthamianaplants，fromwhichonlyweakfluorescencewasobserved．ThemutantsthatshowedabolishedRSSactivityalsoshowedreducedvirulence，implythesetwoprocesseswerecloselyrelated．Keywards：Tobaccoveinbandingmosaicvirus；potatovirus么；HC-Pro；RNAsilencingsuppression；Synergism；Virulence；Agrobacteriumco-infiltration；Potyrvirus}4 本研究受国家自然科学基金(30971895、3047138)资助 ASBCIPbpBSACbCPDEPCDIGDMSOdNTPdpidsRN人EDCELlSAGFPGUSIl(：．ProhpRNAKankDaI。BMESMOPSNBTntPVAacetosyringone符号说明5-Bromo··4··chloro··3··indolylphosphatep-toluidinesaltbasepairbovineserumalbumenCarbenicillincoatprotein．diethelpyrocarbonatedigoxigenindimethylsulfoxidedeoxyribonucleosidetriphosphatedayspostinoculationdoublestrandRNA乙酰丁香酮5．溴．4．氯．3．吲哚基磷酸酯对甲苯胺盐碱基对牛血清蛋白羧苄青霉素外壳蛋白焦碳酸二乙酯地高辛二甲基亚砜脱氧核糖核苷三磷酸接种后天数双链RNAl-Ethyl．3．(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidel-(3·二甲氨基丙基)·3·乙基碳二亚胺盐酸盐Enzyme-linkedImmunosorbentAssaygreenfluorescentprotein13-Glucuronidasehelpercomponent·proteinasehairpinRNAkanamycin‘。kilodaltonLuria．Bertanimedium2-(N-Morpholino)ethanesulfonicacid3-fN-morphplino)propanesulfonicNitrotetrazoliumBluechloridenucleotidePotatovirusA酶联免疫吸附测定绿色荧光蛋白13．葡萄糖苷酸酶辅助成分．蛋白酶发夹RNA卡那霉素千道尔顿LB培养基2-(N一吗啉)-乙基磺酸3-洲-吗啉代)丙磺酸氮蓝四唑核营酸马铃薯A病毒 PVPPVXRdRpRifRISCRNAir／rainRT--PCRSDSSiRNASpSSC7I’cpolyvinylpyrrolidone尸otalovirusXRNA-dependentRNApolymeraserifampicinRNAinducedsilencingcomplexRNAinterferencerevolutionsperminute聚乙烯吡咯烷酮马铃薯X病毒依赖于RNA的RNA聚合酶利福平RNA诱导的沉默复合体RNA干扰转|食Reversetranscriptase—polymerasechainreaction反转录酶-聚合酶链式反应sodiumdodecylsulfatesmallinterferingRNAspectinomycinstandardsalinecitratetetracyclineTVBMVTobaccoveinbandingmosaicvirusUTRuntranslatedregion十二烷基硫酸钠小干扰RNA壮观霉素标准柠檬酸盐溶液四环素烟草脉带花叶病毒非翻译区 山东农业火学博士学位论文1前言马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)是侵染植物最大的属(洪健等，2005)。该属病毒主要以蚜虫通过非持久性方式传播，能在世界范围内引起刁i同寄主植物的病害，给农业生产带来巨大的危害。马铃薯Y病毒属病毒粒体为线状，长680"--'900nm，直径1l～15nm。其基因组由一个正单链RNA分子组成，长约10kb，袋_ffI『被2000个CP单位所包围。基因组编码一个大的开放阅读框(ORF)，翻译成的多聚蛋白(340．370kDa)随即被病毒本身编码的三个蛋白酶切割成lO个成熟的蛋白，从N端到C端依次为：P1、HC—Pro、P3、6Kl、CI、6K2、NIa、NIb和CP，最近又托P3中发现了Fh+2移码产生的一个小的开放阅读框，命名为pipo(PrettyInterestingPotyviridaeORF)(Chung等，2008)。码铃薯Y病毒属病毒编码的辅助成分-蛋白酶(Helpercomponent—protease，HC—Pro)礼炳f臻的侵染循环过程中起着多种重要的作用，可以将HC．Pro分为三个区域：N端区域(AA1．100)、中间区域(AA100．300)、C端区域(AA>300)(Plisson等，2003：Urcuqui．Inchima等，2000)。N端半胱氨酸富集区被认为是类似锌指结构的金属结合基序(‘zinc．finger’-likemetal—bindingmotif)，能够控制病毒的蚜传、症状的严重度、基冈纫l的扩增及病毒的积累(Atreya等，1992：Atreya等，1993；Canto等，1995；Yap等，2009)，中间区域在病毒的长距离移动及维持病毒的正常复制中起作用外(Cronin等，1995)，还参与抑制RNA沉默和介导与其他病毒的协生过程(Varrelmann等，2007)。(：端区域是一个类木瓜蛋白酶，能够催化自身从多聚蛋白上切割下来，并且能影响病毒的细胞IW移动(Urcuqui．Inchima等，2000；Urcuqui．Inchima等，1999)，同时也参与抑删I喇A沉默(Varrelmann等，2007)。此外，HC．Pro还能够结合siRNA、自我互作及与20S核糖体互作等功能(Atreya等，1995；Ballut等，2005：Lakatos等，2006：Maia等，1996；Merai等，2006：Urcuqui．Inchima等，2001)。近年来人们比较了不同株系之M的序歹0，通过片段替换或者是进行定点突变，对HC．Pro中起关键作用的区域和氨坫酸位点进行了研究。1．1lIC．Pro参与病毒的蚜传1．1．1蚜传的机理绝大多数马铃薯Y病毒属病毒都是由蚜虫以非持久性方式传播。对于HC．Pro的蚜 烟t爷|j昧带化叶炳毒羽I马铃薯^病毒HC．ProiJ；d控RNA沉默抑制、协生和致病力的机制传作用模型，目前有两种解释，一个是HC。Pro在中问连接了病毒粒子和蚜虫口针(Govie等，1974)。另一种模型是HC—Pro作用于病毒粒子，决定了其能否直接与蚜虫口针结合(Pirone等，1996)。但是越来越多的证据还是支持“桥梁”假说。例如，李向东等(1999)训；明乇米矮花叶病毒(Maizedwa∥mosaicvirus，MDMV)HC—Pro既可以与病毒粒子结f}，也可以直接与麦二叉蚜口针内一种分子量约为56kDa的蛋白互作，而病毒粒子不能直接与麦二叉蚜的口针结合，只能在HC．Pro的辅助下才能结合到蚜虫口针内病毒粒子的附着位点上(李向东等，2002)。马铃薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)、烟草蚀纹病毒(Tabaccoetchvirus，TEV)、烟草脉斑驳病毒(Tobaccoveinmottlingvirus，TVMV)剁小西葫芦黄花叶病毒(Zucciniyellowmosaicvirus，ZYMV)研究的很多结果也都表19jIIC．Pro介导了蚜传过程时是在病毒粒子和蚜虫口针结合过程中起“桥梁”作用(Atreya-j≯，1993：Blanc等，1997；Govier等，1974：Peng等，1998：Syller，2006)，直接作川¨坷毒粒子和蚜虫食道上颚表皮和前肠的结合过程(Syller，2006：Syller，2012)(图1—1)。，Ijjjj一一一一一一一一一一一。1一。一一一1一’一一一一一一一一一、一一一‘一一一。≥cell-surface厂／／receptorsl／：}!：：r÷／U∥玉({C图I·IHC-Pro在蚜虫1『：持久性传毒过程中的作JI=}j模型(Syller，2012)ljig．I一1Modelillustratingthefunctionofhelpercomponent·proteinase(HC-Pro)innonpersistenttransmissionofvirusesby．aphidvectors．(Syller,2012)诩：多研究证据证明HC—Pro在蚜传过程中结合病毒粒子和蚜虫口针的区域是不同的(夺向东等，2000)。目前已经确定KITC中K变为E后能影响病毒的蚜传(Goytia等，2006)，可能的作用机制是这个突变影响了HC与病毒粒子和蚜虫口针的分别互作或者嗡纛t●●J●●l●●1^i●1I■■■■●!n¨¨¨¨“¨H、1．@c 山．东农业人学博士学位论文址。』曲楷的共同互作过程。PVY的非蚜传株系马铃薯C病毒(PotatovirusC，PVC)lI(：．Pro的KITC为为EITC，这一变化使其丧失了与蚜虫口针的结合能力，而不影响其维介粕椎f门农壳蛋白(CP)(Blanc等，1998)。综合以前的研究结果推测HC的N端区域址和蚜虫的口针相作用的，而与病毒粒子结合的区域可能位于HC的N端以外区域(Blanc等，1998)。1．1．2KITC基序与蚜虫口针结合90年代，随着越来越多的病毒的核苷酸序列被测定，很多在蚜传过程中起关键作川f门保j】：=』I《序也被鉴定出来。比较马铃薯Y病毒属病毒的蚜传株系和非蚜传株系PVClIC．Pro的氨基酸序列发现，两个保守的基序发生了变异：一个是PVY蚜传缺陷株系t'VC(PVYC)N．端的KITC(Thombury等，1990)，另一个是ZYMVC．端的PTK(Granier等，1993；Huet等，1994)。并利用cDNA克隆构建突变体，检测了这些突变体的蚜传效率明确了这些基序对蚜传的影响。比较PVC、PVY和很多其他的马铃薯Y病毒属病，髯发现两个保守基序中的变化，一个是KITC中K突变为Q，另外一个是ID基序中Ile突变为Val(Thornbury等，1990：Granier等，1993)。TVMVHC—Pro的KITC基序中赖么C敝(K)变为谷氨酸(E)、．组氨酸(H)或者谷氨酰胺(Q)之后，使TVMV得HC．Pro。比火了蚜传效率，同时也能使TVMV的病毒积累量减少(Atreya等，1993)。比较PVY的蚜传缺陷性株系PVY-ONAT和野生型PVY-O发现PVY-O中KMTC中的K在PVY-ONA'I’中突变为N，这突变不影响HC．Pro的纯化和PVY症状的表达，仅仅使其丧失了蚜f簟活。Fk(Canto等，1995)。1．1．3P，I’K基序与病毒粒子结合IIuet等(1994)证明当PTK基序T(Thr)变为A(Ala)时，使ZYMV的蚜传效率基小个部丧失(Huet等，1994)。Peng等(1998)构建了HC的保守基序PTK的不同的突变体“叫Iyl’K的突变体能够影响蚜传效率，PTK参与了与HC．Pro与病毒粒子的结合过程fl'cng掷，1998)。比较m蚜化株系TVMV．NAT株系和蚜传株系AT的CP的序列，通过序列替换和蚜化枪测发现，CP的DAG基序中G突变为E，能影响病毒的蚜传，这是首次证明CP能参。』I'VY屈痛击的蚜传(Atreya等，1990)。Gal．On等(1992)通过比较ZYMV的蚜f0株系和非蚜传株系的CP，也证明了DAG突变为DTG使其诞失蚜传活性(Gal．On等， 烟草脉带花nt‘病毒和马铃薯A病毒HC．Pro调控RNA沉默抑制、协生和致疵力的机制1992)。缺失CP包括DAG在内的15个氨基酸，李痘病毒(Plumpoxvirus，PPV)-ci乏失蚜传效率(Goytia等，2006)。Blanc等(1997)应用proteinblotting-overlay技术研究了TVMV中CP和HC的互作，首次提供了蚜传过程中CP和HC特异性互作的血接证据。并通过突变技术证明，当DAG变为NAG时不影响蚜传效率，但是当其突变为DAL／HAG／GAG／DGG／DAE时，CP丧失了和HC．Pro结合的能力，病毒也丧失了蚜f％l性(Blanc等，1997)。同时确定了和HC．Pro互作的CP的最小区域是TVMVCPN端的7个氨基酸(DTVDAGK)，并通过缺失CP的C端证明其在HC．CP互作不起作用(Blanc等，1997)。N端15个氨基酸的非蚜传株系PPV-NAT的CP在植物中与HC．Pro能发，I：互作，这种互作可能与病毒的蚜传无关，而与病毒的其他生物学过程相关，比如病诲的短距离和长距离运输过程(Roudet．Tavea等，2002)。利用酵母双杂交技术可以研究HC．Pr0的体外互作(Guo等，2001)，Seo等2010年通过酵母双杂交的方法确定，人i，花叶病毒(Soybeanmosaicvirus，SMV)的HC—Pro与CP的互作过程中，CP的II11lJ(133．148个氨基酸)和C末端(246．265个氨基酸)及HC．Pro的C端(424—459个氨基酸)是必须的。将ZYMV的CPN端替换为芜菁花叶病毒(Turnipmosaicyf，．淞，TuMV)CP的N端时，TuMV的HC．Pro就能协助ZYMV进行低效率的蚜传，推测可能是因为’FuMVN．端不能在ZYMV中J下确折叠，首次报道CPN端能识别不同的HC．Pro(Dombrovsky锋，2005)。基于Plisson等(2003)分析的莴苣花叶病毒(Lettucemosaicvirus，LMV)JIC．I叶。的2D结构，PTK基序可能位于铰链区(hingedomain)，CP和HC．Pro的特异识别足⋯CP的N一端与HC—Pro的铰链区的结构互补性来决定的(Dombrovsky等，2005)。1．1．4其他参与蚜传的位点除了已经证明的DAG、PTK和KITC能够参与CP．HC．Pro互作和蚜传以外，还订．je它位点也能参与这两个过程。通过ZYMV蚜传基序和非蚜传基序的替代实验，i,il!lOJN立i／,：|I．保守位点148位的天冬氨酸(Asp)和FRNK同时分别变为甘氨酸(Gly)和l?lNK时f：『{三够降低蚜传效率(Huet等，1994)。比较非蚜传株系PVY-1与蚜传株系的HC．Pro序列发现两个氨基酸的差异，一个是半胱氨酸富集区域的35位的Gly(G)突变为负电的Asp(D)和355位的S变为G，推测这两个位点可能在蚜传过程中起作用(Canto等，1995)。Blanc等(1998)利用不能蚜传的TEV-HCHXaKITC侵染性克隆证明在KITC没有变化的n订堤下，HC—Pro第lO位的苯丙氨酸(F)突变为亮氨酸(L)使TEV丧失了蚜传效率，ij},lljJ这8 山东农业人学博?l：学位论文个氨』Ib睃位点在’．rEV的蚜传过程中是必需的。另夕},PVY第35位的Gly变为Asp，St／KITC‘1的fj，J．·个氨刍g酸Gly变为Glu也能使本来具有蚜传的株系变为不能蚜传。这两个位点的突变鄙足l，h不带电荷氨基酸突变为带负电的氨基酸而且都位于或者接近KITC的亮氨酸富集I遥域，因此推测这两个位点的突变可能也是通过影响HC．Pro与蚜虫口针的结合起作用(Blanc等，1998)。Flasinski等(1998)比较了花生条纹病毒(Peanutstripevirus，PStV，脱住确认为BCMV一个株系)、花生斑驳病毒(Peanutmottlevirus，PeMoV)和TVMV锋棚‘海f门IIC．Pro序列，发现除了N．端的KITC矛IC．端的PTK外，中间的FRNK$11CCC(I'eMoVI：p为Ala．Ser-Cys，ASC)也与HC．Pro蚜传活性有关(Flasinski等，1998)，当IIC．Pro有ASC基序时，CP上具有DAA基序比具有DAG基序更有利于病毒蚜传。利用酵f：J．舣杂交及双分子荧光互补实验发现，SMV中除了DAG基序中的甘氨酸，CP的第256化的组氨酸及HC．Pro的第455位的精氨酸也是CP．HC．Pro互作和蚜传所必需的(Seo等，2()10a)。一KI，l’C丛序酱遍存在PVY属病毒基因组中，在ZYMV中，KITC基序是以KLSCfI勺形式仃在，在缺失了蚜传活性的ZYMV-HC(一)中，赖氨酸没有变化(Huet等，1994)。IIC．Pro第lO位的苯丙氨酸(F)突变为亮氨酸(L)能使TEV丧失蚜传效率，但是PVY的IIC．Pro在地lO位是都是L，而蚜传活性并不受影响，说明HC．Pro第十位氨基酸的川¨；l的序列对此氨基酸的作用有一定的影响。推测不同病毒间包含第10位氨基酸在内ff，JN端和半胱氨酸富集区域对HC．Pro的作用机制是不同的(Blanc等，1998)。ZYMV的IIC．Pro能够协助ZYMV和TuMV的病毒粒子通过杂食性蚜虫传播而不能通过十字花科蔬菜蚜虫传播，TuMV的HC．Pro只能协助自身蚜传而不帮助ZYMV蚜f0，iil!11)j蚜虫和病毒之问及HC．Pro与病毒粒子之间的识别具有特异性(Dombrovsky等；2005)。Seo等(2010)还证明CPN端缺失时，K143变为A能使CP不与HC．Protlifi：。石iCP全长中引入这个突变不影响其与HC．Pro的互作。推测与HC．Pro互作时，个Kf门CP及缺失了N末端的CP的作用方式不同。在缺失N末端时，CP上会产生新I，|《J’J_f：fi-化点(Sco等，2010a)。1．1．5介导其他病毒的蚜传⋯些丰lI【物病毒单独侵染时不能被昆虫传播，而与其他病毒(辅助病毒)‘复合侵染时这类痫嘶就能够被昆虫传播(Govier等，1974；Kassanis等，197la：Kassanis等，1971b)。复介仪染-It，作为轴助瘸景I存礼的Potyvirus的I-IC．Pro蛋白能够介导1tC．Pro缺陷型或9 烟草脉带花叶病毒和马铃薯A病毒HC．Pro调控RNA沉默抑制、协生和致病力的机制者不能蚜传的同种和相关及不相关病毒的传播(Froissart等，2002)。最典型的例子就是马铃薯奥古巴花叶病毒(Potatoaucubamosaicvirus，PAMV)，PAMV在马铃辫棚f墨Y属病毒HC—Pro存在情况下能够蚜传，比如蚜虫提前或者同时取食了PVY后，PAMV才能够被蚜虫以非持久性方式传播，携带PAMV的蚜虫的传毒时间仅为两个小时。PAMV也是唯一能被蚜传的马铃薯X病毒属(Potexvirus)病毒(Manoussopoulos，2001)。Syller(2012)年完善了Potyvirus做为辅助病毒帮助其他病毒非持久性蚜传fl；)lJ模型(Syller，2012)(图1)。HC．Pro做为可逆的“桥梁”在病毒粒子和蚜虫食道卜钡太皮和前肠的结合过程中起作用。A，两利，不同的病毒粒子和植物汁液r{t的Potyvirus的HC．Pro蛋白被蚜虫携带；B，HC．Pro与虫体组织上的受体特异性的结合，随后附利t病毒结合到HC．Pro上形成HC—Pro—virion复合体；C，HC．Pro．virion复合体结合到蚜』￡ff，J口针上。蚜虫继续取食时，就能将两种病毒传播到其他植株。1．2HC．Pro抑制P,小IA沉默1．2．1抑制RNA沉默机制RNA沉默(RNAsilencing)现象是真核生物中普遍存在的能抵抗外来核酸入侵的一种防御机制(崔晓峰等2005)，例如病毒在入侵植物时，这种机制可抑制病碡的复制，限制病毒PdqAs在植物中的积累。大多数RNA沉默都是双链RNA(dsRNA)介．甘的，从病毒侵入点产生系统的沉默信号可以传导到整株植物。在长期进化过程中，植物病i≮发展出自己的策略来抵抗RNA沉默，一种策略就是产尘一种蛋白作用于细胞17I1irI：刷RNA沉默信号的传导过程，从而抑制RNA沉默，成功的侵染植物(Voinnet，200I)。TEV的HC．Pro能够抑制病毒诱导的基因沉默，和携带GFP的马铃薯X病毒(PotatovirusX，PVX)侵染性克隆表达载体共同表达时，能抑制GFP的沉默，从而确定HC—Pro灶RNA沉默抑制因子，这也是第一个被鉴定的RNA沉默抑制子(Anandalakshmi等，1998)。HC．Pro蛋白抑制RNA沉默功能被发现以后，许多实验室通过不同的实验方法来试图阐明其抑制作用的分子机制。利用农杆菌瞬时表达和转基因系统检测了TI-VlIC．Pro在RNA沉默过程中的作用，共同注射HC—Pro和GUS能使GUS已经沉默的转水lxltI一，GUS恢复表达，在这个系统中转录后基因沉默(PTGS)和转录的GUS序列3’末端的小RNA的积累及转基因中GUS的接近3’端的特定位点的胞I嘧啶甲基化有关，¨1HC．Pro在这个系统中表达时能抑制转录后基因沉默、减少小RNA的积累和影响部分Il；基化产生，因此推测HC．Pro作用于RNA沉默的维持阶段，不lCJhk沉默信号的，沁盟i界： 山东农业人学博I：学位论义系统化导过程(Llave等，2000)。Mallory等(2001)利用嫁接实验证明TEVHC．Pro介·吁的转录后基因沉默不能阻止植物产生和传递沉默信号，而是阻止植物对沉默信号做⋯反应，但是不同的是HC—Pro不能干扰GUS转基因甲基化的产生，作者推测是因为实验办法的不同导致的。因此推测HC．Pro作用于转基因甲基化和信号移动的下游，能阻tl-'l'RNA的积累(Mallory等，2001)。捕获siRNA与结合双链RNA可能是病毒抑制RNA杉C默的通用策略，Lakatos等(2006)发现，与其它RNA沉默抑制因子一样HC．Pro通过捕获siRNA来抑制RNA沉默(Lakatos等，2006)，Merai等(2006)证明HC．Pro其千j．结合双链RNA的能力(Merai等，2006)。lIC．Pro能够改变很多种类的小RNAs的积累：沉默过程中dsRNA直接降解产生的siRNA、功能未知的比siRNA稍微大一些的RNA(slightly—largerRNA，25．27nt)和调挖}lIt物JI《冈表达的内源microRNA(Roth等，2004)，Mallory等(2002)利用三种转基⋯J髟J=I：(sense-transgcnes，inverted—repeattransgenes，andamplicon-transgenes)来分析了lIC—Pro对siRNA和miRNA的影响，证明HC．Pro能够增加dsRNA的积累，抑制siRNA的移{累，相反的能够增加miRNA的积累，这个试验结果说明HC．Pro抑制了双链RNA被JJllSl-'-成siRNA这一过程，即Dicer切割双链RNA的功能受到抑制，另外也表明切割似标刍蜒因mRNA的R1SC复合体的功能也可能被抑制了。同时发现在inverted．repeattransgenes和amplicon—transgenes转基因有25．27nt的小RNA出现，HC．Pro能够增加这州jRNAf内j{}{岽，这些RNA的作用不详，虽然在瞬时表达系统中，这些较长RNA和相J澎mRNAf内降解没有联系，但是和系统沉默以及同源DNA甲基化有关(Hamilton等，2002；Mallow等，2002)。2000年，Urcuqui．Inchima等利用缺失得到了PVY中HC．Pro111结合核酸的两个区域，DomainA包括89．230个氨基酸，DomainB包括234．366个钒j。I酸，并且当B区域截短到234．32l时仍具有RNA结合能力，说明RNA结合的关键lx-域小：1二B区域，并且B区中其关键作用的是Y288，当其突变成D时影响其结合RNAn勺能力，作析还iil(明与HC．Pro体外互作的核酸长度大于17个核苷酸。利川酵f{j=双杂合系统发现烟草中有8个蛋白能与TEVHC．Pro互作，其中一个是与卡ll【物钙渊索相关蛋白，称为(rgs—CaM)。Rgs．CaM能在瞬时或转基因植物中过度表达州。产：，{i类似于tiC．Pro一样的抑制RNA沉默活性，表明rgs．CaM通过钙依赖的凋控途符水允当RNA沉默的内源抑制因子，而HC—Pro能够增强rgs．CaMmRNA的表达水平，拊测lIC．Pro利rgs．CaM的抑制RNA沉默的机制可能是：一是在HC．Pro水平降低时，ItJ．以越过内源的rgs-CaM干扰RISC的形成，从而抑制RNA沉默。另一种是rgs．CaMIl 烟竿：脉带花叶病毒和马铃薯AjIji毒HC．Pro调控RNA沉默抑制、协生和致病力的机制为RISC的组分，HC—Pro通过与rgs—CaM互作干扰RISC的形成。而且过度表达rgs．CaM的转基因植物能产生像HC．Pro转基因的植物一样的畸形，表明rgs．CaM可能与IIC，Pro类似干扰了miRNA介导的发育调控(Anandalakshmi等，2000)。因为结合了钙f门钙洲素往往是具有活性的蛋白，鉴定rgs．CaM的下游靶标可能能够鉴定到其他内源n勺刈‘j：：fC默起抑制作用的因子(Moissiard等，2004)。尽管HC．Pro抑制RNA沉默的机制很复杂，但是现在主要有两种途径，一是干扰了抑制病毒来源siRNA引起的RNA沉默过程，另外一个是干扰了寄主细胞·l-Pre．miRNA来源的miRNA介导的沉默过程(Pallas等，2011)(图1．2)。在第一种。}．譬况中HC．Pro又至少在两个步骤中起作用(Tortes．Barcel6等，2008)，(1)HC．Pro能够I峁低但是并不完全阻止dsRNA被Dicer降解，siRNA还能被检测到并没有完伞消火(Dunoyer等，2004；Mallory等，2002)：(2)虽然siRNA能够检测到，但是HC．Pro能阻止mRNA降解，推测HC．Pro能够干扰RISC复合体的组装和活性(Chapman等，2007；Dunoyer等，2004)AmpImCati／《SGS3’·LRDR61》山五圆皿瓯叫山u麓警o⋯‘谴兰-∥争Pr争mI茸ⅡIII—III—IIl—itl—ttl皿lltll扁Dicingl《殛薹》I眦jng盎昏墙；RlS．C1-吣五麦》I慧、幽卜2ji；i毒相关的P,NA沉默关键步骤示意圈(Pallas等，201I：Valli等，2009)Fig．I·2Schematic他pre辩ntationofthekeystepsinvirus—relatedRNAsilencing(Pallaseta1．．201l：Vallieta1．．2009) 山东农业人学博：I：学位论义12．2抑制RNA沉默的功能位点’．；2003年，Plisson等分析了HC．Pro的结构，提出HC．Pro的中间区域是RNA结合、抑制PTGS和VIGS所必须的区域(Plisson等，2003)。利用五肽筛选系统(pcntapeptide-insertionscanning)确定HC—Pro的中间区域是抑制RNA沉默所必须的，⋯¨iil圳JC末端除了具有蛋白酶活性外同样也参与抑制RNA沉默过程(Varrelmann等，2007)。2008年Torres．Barcelo在HC．Pro中随机引入突变能影响HC—Pro致病性和抑制I卜义IyI’GS活性，说明除了HC—Pro的中间区域，其他的位置对于HC—Pro抑制PTGS羽lVIGS也是非常重要的(Torres．Barcel6等，2008)。将野生型PPVHC．Pro134位的亮氨酸(L)突变为组氨酸(H)能使HC．Pro的瞬lI、f衫[默抑制活性丧失，同时也使PPV和PVX的协生作用丧失，首次确定PPV中HC．Pro的’一个．雌位点的突变就能影响HC．Pro的抑制RNA沉默活性和协生作用(Gonz／flez．Jara等，2005)。ZYMV中FRNK是HC．Pro结合siI酬A和miRNA所必须的保守基序，当jC突，叟为FINK时，影n向了HC．Pro和miRNA的亲和性和ZYMV的症状表现，但是并／卜"片1圳11l—tIJIIC．Pro的抑制RNA沉默的活性，推测FRNK可能依靠影响内源miRNA的积累水介!t症状的发生(Shiboleth等，2007)。通过比较三叶草黄脉病毒(cloveryellowveinvirus，CIYVV)致命坏死株系和其自然突变的花叶株系序列比对发现，HC．Pro中有两个氨基酸的差异，分别进行定点突变，L!lJ，1271和D193Y，突变后发现两个突变位点均使HC．Pro的抑制RNA沉默活性降低(Yambao等，2008)，并且这两个位点的突变使症状减轻，其中T27I能引起坏死但是1：址敛命性的，而T27IDl93I和D193Y只能引起褪绿斑驳和花叶症状，因此当D193仃存||、r能使CIYVV不引起坏死，因此推测CIYVV中HC—Pro的抑制RNA沉默活性和勘i夕匕症状的农达是成力i相关的。T27位于C端的一个类似锌指结构域，D193位于一个L绛豁定的HC．Pro核酸结合域的N端(Urcuqui．Inchima等，2000)，这两个区域是HC．Pro’rR婴{征铃，其中类似锌指结构能和核酸互作，是HC．Pro自身互作所必需的(Urcuqui．Inchima等，1999)，尽管D193在PVY属病毒中是不保守的，但是它具有特姝f内f移代，位于FRNK保守基序下游9个氨基酸的位置，并与保守基序L×CDNQLD的N端11l邻．W此I)193可能是通过影响这两个保守基序以及RNA结合域来起作用(I)csbicz笛，2010：Yambao等，2008)。MicroRNA在植物的生长发展过程中起作用，包括调控器官的分离，极性和特性等， 烟草脉带化叶炳毒和马铃薯A炳毒HC．Pro调挖RNAi7c默抑制、协生和致病／J的机：Ij0例如在拟南芥中miRl59，miRl60，miRl64，miRl65，和miRl68的积累水平与叶片们牛·长有关(Dugas等，2004)。HC．Pro能够干扰拟南芥miRNA的途径，使植株表现，}常(Dunoyer等，2004)。ZYMV强毒株系TW．TN3分别以单位点、双位点的方式,-jf入三一个氨基酸位点(R180I、F205L和E396N)的突变，均能使ZYMV的症状减弱，≥川IR180IE396N突变体可以用来进行交叉保护植株不受强毒株系的侵染，但是通过检测．jeCP的含量，确定这个突变位点不影响HC．Pro的PTGS活性(Lin等，2007)。Wu等(20l0)年检测了R180I、F205L和E396N的不同组合病毒致病性和症状发展有关的小RNA的途径中的作用，发现在转HC．Pro单位点和双位点突变体中miRNA的积累量与转野牛型HC．Pro的植株中miRNA的积累量一样多或者稍微少于野生型，说明HC．Pro即．位』_或者双位点突变体RNA沉默起部分抑制功能。还证明在抑制miRNA途径的过程·I-，起关键作用的是R180位点，而F205和E396两个位点对R180起促进阱同作JlJ。Trans．actingsiRNAs(ta—siRNAs)在叶片的极性、生长及相变的过程中起作用(Pcraginc等，2004)，研究发现R180I、F205L或E396N这三个位点的突变在ta．siRNAs介．甘l，|勺叶片发展和通过阻止miRNA介导在ta—siRNA的生物合成来影响叶片从幼期到成熟j!；JJ的相变过程中起重要作用。作者还验证了这三个突变体在抑制VIGS和sense(s)一PTGSrlt的作用，证明虽然R180、F205和E396在HC．Pro抑制miRNA和ta．RNAs的途径lll址重要的功能位点，也同时在VIGS过程中起作用，但是不影响HC．Pro抑制s．P，I’GS过袱(Wu等，2010)。最近有报道称DCL4在病毒siRNA产生过程中起作用(Bouch6等，2006)，而DCL在s．PTGS途径中起作用(Mlotshwa等，2008)，推测HC．Pro突，叟体在两种途径中的作用不同导致了对抑制VIGS和s．PTGS的影响不同(Wu等，2010)。Torres．Barcelo等(2008)根据以前的报道构建了TEV的28个突变体，利川实时荧光定量PCR的方法检测GFP的表达量来确定突变体的抑制RNA沉默活性，九个突变体完全丧失抑制RNA沉默活性，其中V135A丧失了抑制RNA沉默活性，与PI)V111L134H的结果一致，三个突变体的抑制活性降低(降低1．4—7倍)，五个突变体的抑制活性增加(增加1．1．2．4倍)，其余的突变体与野生型HC．Pro没有明显区别。首次羚定出RNA沉默活性增强的HC—Pro突变体，推测在HC．Pro中使其抑制RNA沉默活倒i增强的突变体在自然界中可能普遍存在，只是由于测定方法的局限性而没有被鉴定⋯米。1．3HC—Pro参与病毒的协生作用＼越来越多的证据表明，在植物及动物中病毒的复合侵染现象是普遍存在的(Dapalma14 山东农业人学博．I：学位论文博，2010)。植物病毒的复合侵染可以分为协生和对抗两种情况，两种或多种病毒复合一仪染』ifj--．个寄主植物，导致其中一种或者两种病毒的积累量增加，并且病毒间的相互作川能引起比其一I-任何一种病毒单独侵染更加严重的症状，这种现象被称作协生作用(Pruss等，1997；Syller，2012；Vance，1991；Wang等，2009)。关于病毒协生作用的机耻方面还没有明确的定论，目前大家普遍认为是RNA沉默抑制子介导了协生作用，但灶桐同的病毒在不同的寄主植物上可能引起或协生或不协生又或者不同的协生模式，说Ipjb’'-J-ff：用可能是由病毒基因与寄主植物基因之间，病毒与病毒之间复杂的相互作用的绌粜。1．3．1协生作用具有寄主依赖性不例病薄在不同寄主植物上的协生现象被广泛报道，复合侵染的植株中，病毒的秽{祟嫩是否增加是具有寄主依赖性的。其中最具有代表性的就是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒参与的协生作用，而其中最经典的例子就是PVY与PVX的卧生，相对‘孑．睡独侵染，这两个病毒复合侵染普通烟(Nicotianatabacum)时能引起更严重的症状，⋯时PVX的病毒积累量能够增加3．10倍(Vance，1991)。然而在本氏烟(Nicotianahenthamiana)l=11，PVX与PVY、TEV或者PPV共同侵染时，虽然能够引起植株的系统性坏死，但是PVX的病毒积累量并没有明显的增加(Gonzzilzz．Jara等，2005：Gonzfilez．Jara等，2004)，同时证明协生作用所引起的严重症状表现不是由病毒RNA私{累的水平直接引起的。另外同样的现象还发生在番茄褪绿病毒(TomatochlorosisⅢitilX，’IoCV)和番茄传染性褪绿病毒(Tomatoinfectiouschlorosisvirus，TICV)的协生j』稚-|I(Wintcrmantel等，2008)，相对于单独侵染，在本氏烟中TICV的病毒积累量埔川|f|j"IbCV的病毒积累量是降低的。在Physaliswrightii中两个病毒的积累量都能够增JJII。征协生过程中除了病毒积累量具有寄主依赖性外，症状的表现也具有寄主依赖性，‘6亡斯带克辣椒病毒(Pepperhuastecovirus，PHV)和辣椒金色花叶病毒(Peppergoldenmostdcvirus，PcpGMV)同时普通烟和本氏烟时能够发生协生作用，而在辣椒巾则发生埘j)．I：作川(Antagonism)(M4ndez．Lozano等，2003)。另外有证据表明协生模式不仅与夼1州【物的种类有关，而且与寄主植物的品平4·有关系(Tatineni等，2010)。1．3．2参与协生作用的病毒及受益病毒 7病毒的协生作用主要是不相关的多种病毒在相同的寄主细胞中的互作产生ff'JgJi果。7但是在甘薯羽状斑驳病毒(Sweetpotatofeatherymottlev护淞，SPFMV)和甘薯褪绿矮化病毒(Sweetpotatochloroticstuntvirus，SPCSV)的协生作用中，只能侵染韧皮部的SPCSV与SPFMV并没有在非韧皮部细胞中相互作用，却能够使非韧皮部细胞rfl的SPFMV的浓度明显提高(Karyeija等，2000)，作者推测可能有两个原因：一是SP('SV的特定蛋白能够从韧皮部中运输到其他组织，介导协生，加速SPFMV的复制：：：址SPCSV能够阻止甘薯产生用来抵抗SPFMV侵染的系统性韧皮部依赖的信号(Karycija等，2000)；同样的当韧皮部局限性的马铃薯卷叶病毒(Potatoleafrollvirus，RI。RV)与PVY共同侵染马铃薯时能够引起相对于两种病毒单独侵染更为严重的症状，但是两个病毒的积累量都没有明显的变化(Srinivasan等，2007)如上所述，多数的协生作用是发生在不相关的病毒之间，但是那些或多或少订黪火系的病毒之问也可以发_i互作，如菜豆金色TEnt‘病毒属(Begomovirus)病’嘶f门小嘲五毒(Chakraborty等，2008：M6ndez．Lozano等，2003：Renteria．Canett等，20lI：Sufrin．Ringwald等，2011)，如瓦斯蒂克辣椒病毒(PHV)和辣椒金色花叶病毒(PcpGMV)(M6ndez—Lozano等，2003)、南瓜曲叶病毒(Squashleafcurlvirus，SLCV)和两瓜键绿矮化病毒(Watermelonchloroticstuntvirus，WmCSV)(Sufrin．Ringwald等，2011)。马铃薯Y病毒科(Potyviridae)中，属于Tritimovirus的小麦线条花叶病矗l(Wheatstreakmosaicvirus，WSMV)和属于新的暂定属Poacevirus的小麦花I}I．瘸啦(Triticumnlostti6·virus，TriMV)在小麦上也能发生协生作用(Tatineni等，2010)。在大多数已经报道的例子中，马铃薯病毒属病毒在与其他异源病毒发生互作时，potyvirus的积累量不受影响或者有轻微的降低，而nonpotyvirus的积累量增加。例如TVMV、PVY或者TEV与PVX的协生(Rochow等，1955：Vance，1991：Vance等，1995)、TuMV与黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)的协生作用(Sano等，1989)。但是相反的情况也是存在的，即在协生过程中受益的是potyvirusIfI川i址nonpotyvirus。例如PVY和烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus，ⅣV)共同侵染!§铃薯野生种(Solahumbrevidens)时，PVY的病毒积累量是增加的(Valkonen，1992)，甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)复合侵染甘薯时也发￡Ii类似情况，属于马铃薯Y病毒属的SPFMV的病毒浓度有明显的提高(Cucllar等，2008：Karyeija等，2000；Mukasa等，2006)。此外，在小麦花叶病毒属(tritimovirus)f门小麦线条花叶病毒(WSMV)与玉米褪绿斑驳病毒属(Machlovirus)玉米褪绿斑驳瓶心16 山东农业大学博：L学位论文(Maizechloroticmottlevirus，MCMV)共同侵染玉米时，’两种病毒均是受益方(Scheets，1998；Stcnger等，2007)，另外在PVY与CMV的协生作用中，只有两者共同侵染番删时两种病毒的浓度才能都提高(Mascia等，2010)，在其他寄主植物不引起这种结果。1．3．3参与协生作用的病毒基因十u同的两种病毒侵染不同的寄主植物时引起的协生作用模式不同，这可能是因为病j准^《㈨与不同寄主植物基因之间相互作用，相互斗争的方式及结果不同所导致的(Syller，2012)，所以了解病毒的哪些基因参与了协生作用的过程对于了解协生作用的机蔓l!是至关重要的。目前已经鉴定的参与协生过程的基因大多是一些RNA沉默抑制子。马铃薯Y病毒属病毒编码的HC．Pro能介导自身病毒参与的协生作用，而同是马铃!)!fY病毒科的其他属病毒编码的HC．Pro则不一定能够介导该病毒与其他病毒的协生(Stcngcr等，2007)。Vance等(1995)就利用转基因的方法证明在TVMV、TEV与I'VXf门阱化作用中，TVMV与TEV的全基因组的复制不是必须的，而起关键作用的片段址J^吲约【的5。．端，包括P1．HC．Pro．P3的区域(Vance等，1995)。Pruss等(1997)itliIJ)J表达TEVP1／HC．pro序列的转基因烟草与TMV和CMV也能发生协生作用，同时作杆利用嵌合载体证明Pl和P3编码的序列在协生作用中不是必需的，HC．pro的编码，^：物介导了协生作用，而不是其核酸本身(Pruss等，1997)。HC．Pro可能是通过抑制l'．1’GS来介导协生作用，如小麦花叶病毒属病毒WSMV编码的HC．Pro不具备抑制转录Jl“≮⋯})C默活性，同样也不能介导WSMV与MCMV的协生作用(Stenger等，2007)。fI!；Z--，Z【：GonzAlez—Jara等(2005)在文章讨论中提到，在potyvirus．PVX的协生作用中川‘能存住多种RNA沉默途径被干扰的状况而不仅仅是PTGS过程(Gonz舀．1ez—Jara等，2005)。Kasschau等(2003)证明TuMV的HC．Pro基因除了能抑制PTGS外，还能够：l：扰micro．RNA(miRNA)介导的mRNA的降解(Kasschau等，2003)，这个过程也址RNA杉C默f内一利-形式。研究发现PVY、TuMV和C1YVV分别与CMV共同侵染本氏删州‘，PVY的IIC．Pro能更有效的增加CMV的浓度。两种病毒共同侵染或者CMVf2染转PVYlIC．Pro的烟草时都能够克服CMV的“Cyclingpattern”。但是在转基因烟III川-CMV的病毒积累量增加程度更大，而且CMV的3a蛋白表达量也是相应增加的，⋯此，作者认为CMV与PVY的协生作用是PVYHC．Pro抑制RNA沉默的结果，而且CMV3a运动蛋白可能也参与了这个过程(Fukuzawa等，2010)。除了lIC．Pro，je他病毒编码的一些蛋白也具有抑制RNA沉默的活性(Niehl等， 烟草脉带花叶病毒和马铃薯A病毒HC·Pm调控RNA沉默抑制、协生和致瘸力的机制2011；Qu等，2005；Roth等，2004)。不同病毒的RNA沉默抑制子通过不同的方式抑制PTGS，这就导致其介导的协生作用的模式可能会有所不同，比如，PVX的P25删人i通过干扰RNA介导的RNA聚合酶(RNA．directedRNApolymerase，RdRp)的1"1；JIj米阻止移动沉默信号的积累(Voinnet等，2000)，同时还能通过降解Agonaute蛋白来越作用(Chiu等，2010)。WSMV与MCMV在玉米上的协生不是由WSMV的HC．Pro介导的，WSMV可能存在其他的蛋白来抑制PTGS和介导协生作用(Stenger等，2007)。1．3．4HC—Pro参与协生的区域和位点人们最早是利用转基因和PVX侵染性克隆表达表达外源基因的方法证明HC．Pro编码的基因产物介导了potyvirus与PVX的协生作用(Pruss等，1997：Vance等，1995)。随后对于HC．Pro中对其介导协生起关键作用的区域和基序进行了研究。Shi等(1997)年通过转基因烟草证明，在HC．Pro的中间区域引入突变的转基因植株丧失了与PVXfI，J互作，而在P1基因中引入突变的三个转基因植株与PVX能够正常协生并能够使PVX的病毒积累量增加，作者同时构建的缺失类似锌指结构域(Zincfinger-likedomain)f仃转基因植株也具备与PVX的协生能力，就是说HC．Pro的中问区域足协生作片J和PVX大量复制所必需的，而前66个氨基酸构成的类似锌指结构域则对两个过程没有影响(Shi等，1997)。鲁瑞芳等(2001年)将HC．Pro的序列分区段转化烟草，同样证明HC．t'ro的中心区域能够介导PVY-C株系与CMV或者PVX的协生(鲁瑞芳等，2001)。李为民等(2001)将位于HC．Pro中间区域的CCCT和PTK基序进行了突变，获得了CCCT位点的包括缺失型在内的三个突变体(Del、RGAE、CRRT)和PTK的一个突变体(P’I'A)，通过转基因的方法证明这四个突变体都不能能与PVX引起协生作用，说明CCC'I’和PTK基序是PVY-CHC—Pro介导PVX／PVY协生作用所必需的(李为民等，2001)。Sacnz等(2001)通过比较不同症状的PPV分离物的序列，然后将不同的氨基酸突变引入PVX．HC嵌合载体证明107为是谷氨酸(E)更有利于PPVHC—Pro介导与PVX的I办化作用(Sfienz等，2001)。Yang等(2002)在与蚜传相关的两个基序上引入突变，c!IJPTK变为PTE，KITC变为EITC，利用PVX．HC嵌合载体证明PVX．HCPTE在本氏词_i4上只引起花叶症状，而PVX—HCEITC则能够在本氏烟上引起坏死，但是后期症状会恢复，可能与HC．Pro后期被剪切掉有关系，说明位于HC．Pro中间区域的PTK基序赴HC．Pro介导协生所必需的，而同样是蚜传相关基序EITC则不是必需的(Yang等，2002)。GonzAlez—Jara等(2005)通过比较PPV的蚜传株系和非蚜传，突变了可能参与协￡卜作 山东农业人学博l：学位论义川I，I勺lIC．Pro的中间区域的两个位点，证明134位的Leu(L)突变为His(H)后使HC．Pro’艇火介导协生的能力，同时利用瞬时表达系统证明HC．ProL134H突变体同样丧失了抑制RNA沉默活性，表明HC．Pro的这两个功能具有相关性(Gonzfilez．Jara等，2005)。1．3．5协生作用带来的危害岍种病毒在协纠i过程中能够克服植物对其中一种病的的抗性，使非寄主植物变为寄l喇【物，从而扩大了病毒复合侵染时的寄主范围。例如，与ToCV协生作用能够克服jj{；；特转丛因Sw．5基因的番茄对番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus，TSWV)抗性(Garcia．Ca_no等，2006)；CMV与ZYMV的协生作用可以黄瓜抗性品种CV．Delila中CMV的IONIA及CP的积累，但是症状没有明显的变化，同时说明在抗CMV的黄瓜植株巾病毒的积累和症状发展是由不同的基因调控的(Wang等，2004)。SPFMV侵染马铃嘶．IIIl干-fIcv．"lhnzania能引起系统侵染，但是只有很少的病毒积累量，与SPCSV发生协小肝，能够使SPFMV的RNA和CP增加600倍(Karyeija等，2000)。因此，田间作为瘸所i存在的病毒间发生的协生作用，会使植物丧失对病毒病原的抗性而引发更严重的绛济：}f『j失。。病繇在自然界中的协生作用中，传毒昆虫的传毒情况是值得被关注的，因为它可能会·1}I发严重的生态学和流行学后果。两利，病毒病的互作可能会引起以下的结果。一是提尚J7介体昆虫的传毒效率，昆虫的传毒效率是通过估算带毒昆虫所能引起的被侵染植株I，1．1分数禾j到的。这与昆虫之前取食的植株中的病毒浓度成J下相关，即一种或者两种病毒的浓度的增加可能能够增加昆虫的传毒几率(Froissart等，2010)。例如，毛形病毒属f门岍种病碰番茄褪绿病毒(ToCV)和番茄侵染性褪绿病毒(TICV)通过粉虱(Homoptera．"AleynMidae)的传毒效率的高低与病毒在植株中的的浓度高低是一致的(Wintermantels,¨iN，2008)。Tatincni等(2010)年证明螨从WSMV和TriMV复合侵染的植株上的f之毒效牢比从单独感染WSMV或TriMV的植株上的传毒效率要高(Tatineni等，2010)。最新的训嘞；表明复合侵染的植株中介体昆虫的传毒效率更高的原因，不仅仅是病毒积累量九勺J：{}7：|J『I，还可能是因为复合侵染的植株中病毒的分布范围更广，使得昆虫在取食中更容幼接触病部(Mascia等，2010)。二是病毒的复合侵染能影响昆虫介体的偏好性和其生物。浮特。t'l-。桃蚜(Myzuspersicae)和马铃薯长管蚜(Macrosiphumeuphorbiae)(Homoptera．，Iphidi(kte)分)jlJ足能彳_J．效传播RI。RV和PVY的介体昆虫，在RLRV和PVY共同侵染fI‘J4：l‘【株·II，PVY的传捅效率比单独感染PVY的植株的传毒效率有明显的提高，而RLRV19 烟草脉带仡叶炳毒和马铃薯A炳毒HC．Pro调控RNA沉默抑制、协生和致躺力的机制的传播则不存在这种现象(Srinivasan等，2007)。作者推测，可能是因为RI。RV是维1’；束限制性的病毒，因此在复合侵染或者自身单独侵染的植株的维管束中的糖分和氨^《酸的积累量要高于PVY单独侵染的植株。另外还发现蚜虫更喜欢在复合侵染的植株．I-L-"植，这叫‘能是复合侵染的植株在外观和释放的气味上更能刺激蚜虫的视觉和嗅觉(Srinivasan等，2007)协生作用中，植物介导的病毒与传毒昆虫介体之间的互作可能在病毒的流行学力’ifIl具有重要的启示，因为很多病毒间经常以复合侵染的形式存在(Chatzivassiliou等，2008：Srinivasan等，2007)。协生作用增强了病毒的致病力、扩大了寄主范围致使病谢的易艚品种增加，最终将会给生产带来巨大损失(Kareem等，2007；Malik等，2010；Murphy等，2006；Tatineni等，2010；Zhang等，2001)。自然发生的两种或者三种病毒复介侵染产生的协生作用能导致作物上的发生毁灭性病害，能使植物永久性坏死。例如，玉米的致死性坏死病害(Camlethalnecrosisdisease，CLN)是由MCMV与马铃薯Y瘸『{j；属的玉米矮花叶病毒(Maizedwarfmosaicpotyvirus．A，MDMV-A)、WSMV或者‘”娥花叶病毒(Sugarconemosaicpotyvirus-MD—B，SCMV-MD-B)共同侵染所导致的(Goldberg等，1987；Niblett等，1978；Scheets，1998；Uyemoto等，1980)、小磐化叶病毒(cassavamosaicdisease，CMD)是由非洲木薯花叶病毒(Africancassavamosaicvirus，ACMV)和东非木薯花叶病毒(EastAfricancassavamosaicvirus，EACMV)参与的两种假重组病毒引起的(Pita等，2001)、由甘薯轻斑驳病毒(Sweetpotatomildmottlevirus，SPMMV)和SPCSV引起的甘薯病毒病害(Sweetpotatovirusdisease，SPVI))(Mukasa等，2006：Untiveros等，2007)。因此，阳间防治病毒协生产生的病害时要从以下几个方面入手：(1)要种植抗}I如·协种：(2)提前预防可能发生的病毒协生作用；(3)生产无病毒侵染的种子材料：(4)赴控制病毒的昆虫传毒介体(Kareem等，2007；Tatineni等，2010)。1．4HC—Pro参与病毒的致病力植物病毒成功入侵寄主植物，必须完成以下四步：(1)进入植物细胞：(2)确；域初侵染的细胞中复制；(3)通过胞I’日J连丝进行细胞问移动：(4)通过维证’爪系统进}J：长距离运输(Syller，2006)。总的来说，病毒能否成功侵染植物与其复制水平及能rj系统侵染密切相关。调控病毒细胞问移动的病毒编码的蛋白已经成功的被鉴定(Carrington等，1996；Deom等，1992：Lazarowitz等，1999)，但是控制细胞“IJK蝴! 山东农业火学阱I：学位论文离运输的病毒编码的蛋白还不是特别清楚，包括很多病毒的CP基因以及很多其他未被拾定的旗因(Carrington等，1996：Citovsky等，2000；Seron等，1996)。马铃薯Y炳i臻属病毒编码的蛋白包括VPg、CI、P1、CP、P1、HC．Pro等基因或多或少都与病毒的移z力。：J复制有关系(Andersen等，1998：Carrington等，1998；Chiang等，2007：Cronin笛，1995；Rajamaki等，2002；Salvador等，2008)。作为一个多功能蛋白，HC．Pro的各种功能都被人们进行了深入的研究，HC．Pro的刁i『-司区段从多个方面参与了病毒的致病性和致病力，HC．Pro的N．端除了参与蚜传外，迩能影响致病力(症状发展)、基因组复制和病毒积累量(Atreya等，1992；Atreya等，1993：Kasschau等，1995)，C．端影响了病毒的长距离运输和复制维护(Cronin等，1995；Kasschau等，1997：Klein等，1994)，C端可能参与了病毒的细胞间移动(Rojas等，1997)。而有时候HC．Pro的改变可能会引起病毒浓度、核酸复制水平和长距离移动等农型川司时发生改变，而有些HC．Pro的突变体则只能影响一个表性，可能是因为HC．Pro的这螳功能域之间有重合，同时单个氨基酸位点可能具有“多功能”性。1．4．1参与病毒致病过程的特点1§铃薯Y病毒属病毒HC．Pro在病毒系统移动中的功能具有高度寄主特异性，PPV彳i能系统侵染普通烟(Ⅳ．tabacum)，能够系统侵染转化TEV5’．端的普通烟。Sfienz等(2002)利用Nine．nucleotideinsertions法得到了Pl和HC—Pro的6个突变体转基因植株，证明HC．Pro中间区域突变后能够影响TEV5’．端对PPV不能系统移动的互补作用(S：acnz等，2002)。SMV．G7HHC．Pro的一个氨基酸点位点(P359S)的变化就能在⋯『’f挑；|f}3：Rsvl和Rsv3的大豆上引起症状变化，但是在只携带Rsv3基因的大豆上不引，迎变化(Seo等，2010b)。‘IIC．Pro的不同位点之间以及HC．Pro与其他基因间可以协同作用，在致病性和致病力I：引起比单位点突变更大的变化。例如，ZYMV的三个位点(R1801／F205L／E396N)被引入到TW．TN3中，发现这三个位点能降低ZYMV在西葫芦上的致病性，并能阻碍JC
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