赛葵黄脉病毒（MYVV）和烟草曲茎病毒（TbCSV）及伴随β卫星之间的互作研究

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单位代码10635学号112013327001855硕士学位论文赛葵黄脉病毒（MYVV）和烟草曲茎病毒(TbCSV)及伴随β卫星之间的互作研究论文作者：胡燕指导教师：青玲教授学科专业：植物病理学研究方向：分子植物病理学提交论文日期：2016年5月31日论文答辩日期：2016年6月03日学位授予单位：西南大学中国重庆2016年5月 SouthwestUniversityM.Sc.DissertationTheinteractionbetweenMalvastrumyellowveinvirusandTobaccocurlyshootvirusassociatedwiththeirbetasatellitesCandidate:YanHuSupervisor:LingQingSpeciality:PlantPathologyResearchField:MolecularPlantPathologySouthwestUniversity,Chongqing,ChinaMay,2016 目录摘要............................................................................................................................IAbstract........................................................................................................................III第一章文献综述.........................................................................................................11双生病毒简介.....................................................................................................11.1双生病毒的分布及危害..........................................................................11.2病原致病性研究.......................................................................................12双生病毒与小分子DNA形成的病害复合体...................................................32.1MYVV/MYVΒ及TbCSV/TbCSΒ病害复合体研究进展......................42.2双生病毒病害复合体各组分之间的互作..............................................53病毒间的相互作用............................................................................................63.1协生作用..................................................................................................63.2干扰作用..................................................................................................74实时荧光定量PCR技术在植物病毒中的检测应用.......................................84.1实时荧光定量PCR的原理.....................................................................94.2实时荧光定量PCR的特点......................................................................94.3实时荧光定量PCR的数据分析...........................................................104.4实时荧光定量PCR的应用...................................................................11第二章引言...........................................................................................................13第三章两种双生病毒及其伴随β卫星实时荧光定量PCR体系的建立与优化..151实验材料..........................................................................................................151.1供试寄主植物........................................................................................151.2病毒及卫星分子的侵染性克隆............................................................151.3试剂、菌株、酶和克隆载体等............................................................151.4常用实验仪器........................................................................................152实验方法..........................................................................................................162.1农杆菌介导的植株接种........................................................................162.2烟草总DNA的提取..............................................................................162.3PCR技术.................................................................................................172.4PCR产物纯化.........................................................................................182.5分子克隆.................................................................................................182.6序列的测定与分析................................................................................192.7标准DNA样品的制备..........................................................................192.8qPCR条件的优化和标准曲线的建立...................................................20i 3结果与分析......................................................................................................213.1MYVVqPCR检测体系的建立及优化.................................................213.2MYVBqPCR检测体系的建立及优化.................................................273.3TbCSVqPCR检测体系的建立及优化.................................................293.4TbCSBqPCR检测体系的建立及优化.................................................314.讨论.................................................................................................................33第四章MYVV与同源卫星MYVB或异源卫星TbCSB之间的互作研究..........371实验材料..........................................................................................................371.1植物材料.................................................................................................371.2病毒侵染性克隆.....................................................................................371.3菌株、酶和克隆载体等........................................................................371.4常用实验仪器........................................................................................372实验方法..........................................................................................................372.1农杆菌介导的本氏烟接种....................................................................372.2植物总DNA的提取.............................................................................382.3普通PCR技术......................................................................................382.4qPCR检测病毒积累量.........................................................................392.5PCR产物纯化........................................................................................412.6分子克隆.................................................................................................412.7序列的测定与分析................................................................................413结果与分析......................................................................................................413.1Y47A伴随Y47β或Y35β的侵染性及症状比较................................413.2Y47A伴随Y47β或Y35β接种本氏烟后Y47A的相对积累量........443.3Y47A伴随Y47β或Y35β接种本氏烟后β卫星的相对积累量........454讨论..................................................................................................................46第五章MYVV/MYVB和TbCSV/TbCSB之间的互作研究.................................491实验材料...........................................................................................................491.1植物材料.................................................................................................491.2病毒侵染性克隆.....................................................................................491.3菌株、酶和克隆载体等........................................................................491.4常用实验仪器........................................................................................492实验方法..........................................................................................................492.1农杆菌介导的植株接种........................................................................492.2植物总DNA的提取.............................................................................50ii 2.3普通PCR技术.......................................................................................502.4qPCR检测病毒积累量...........................................................................502.5PCR产物纯化.........................................................................................502.6分子克隆.................................................................................................502.7序列的测定与分析................................................................................503结果与分析......................................................................................................503.1Y47A和Y35A同时伴随β卫星接种本氏烟的侵染性及症状...........503.2接种本氏烟中各病毒及β卫星的积累量.............................................514讨论...................................................................................................................53第六章结论与展望...................................................................................................571.研究主要结论.................................................................................................572.展望.................................................................................................................57参考文献.....................................................................................................................59附录A：本论文所用缩写词中英文对照..................................................................65附录B：常用缓冲液、培养基及抗生素配方..........................................................67致谢.........................................................................................................................69iii 摘要赛葵黄脉病毒（MYVV）和烟草曲茎病毒(TbCSV)及伴随β卫星之间的互作研究摘要已有研究发现，中国番茄黄化曲叶病毒(TomatoyellowleafcurlChinavirus,TYLCCNV)和烟草曲茎病毒(Tobaccocurlyshootvirus,TbCSV)伴随的β卫星均可被异源辅助病毒复制。但是，两者伴随同源或异源β卫星时诱导的症状明显不同，且病毒的积累量与症状严重程度不直接相关。用TYLCCNV和TbCSV伴随其β卫星同时侵染本氏烟及心叶烟，在整个侵染过程中两种病毒及卫星在本氏烟中始终存在，而TYLCCNV及其同源β卫星在心叶烟中仅侵染前期能检测到，后期均丢失。赛葵黄脉病毒（Malvastrumyellowveinvirus,MYVV）与TYLCCNV属同一致病类型，其β卫星是引起典型症状所必需的；而TbCSV单独侵染即可引起典型症状，但伴随β卫星时症状加重。为了弄清不同致病类型的双生病毒/β卫星病害复合体之间的互作关系，本研究以MYVV的Y47分离物（Y47A）和TbCSV的Y35分离物（Y35A）及其伴随β卫星MYVB（Y47β）和TbCSB（Y35β）为研究对象，以本氏烟为寄主材料，开展了这两类双生病毒/β卫星病害复合体各组分之间的互作研究。根据MYVV和TbCSV及其伴随β卫星全基因组的保守序列，设计病毒及β卫星的特异性引物，以发病叶片DNA为模板，优化反应条件，建立了扩增病毒及β卫星的实时荧光定量PCR（qPCR）检测体系，并对其进行了灵敏性和重复性检验。以102-108copies/μL这7个浓度梯度的标准品DNA为模板建立标准曲线，结果表明，该标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，扩增效率在90-110%之间，在qPCR扩增效率范围内；标准曲线的相关系数在0.998-1.000之间，说明该体系有较好的检测效能。该qPCR方法最低检测限为10copies/μL，其灵敏度是常规PCR的100倍。将Y47A、Y47A+Y47β、Y47A+Y35β的侵染性克隆分别接种本氏烟，观察症状发现，单独接种Y47A的本氏烟不表现症状，接种Y47A+Y47β的本氏烟表现严重的向下叶卷，皱缩，黄脉，脉增厚等症状，接种Y47A+Y35β则表现植株矮化，茎严重扭曲，脉增厚,没有观察到黄脉和叶皱缩现象,Y47A侵染率为54.5%，Y47A+Y47β在本氏烟上的侵染率为100%，而Y47A+Y35β的侵染率则为72.7%，且显症时间（4d）也早于Y47A+Y35β（7d）。qPCR分析结果显示，接种Y47A+Y47β、Y47A+Y35β的本氏烟中Y47A的积累量均要高于单独接种Y47A的本氏烟，说明β卫I 西南大学硕士学位论文星的存在提高了其辅助病毒Y47A的积累量。异源卫星Y35β伴随Y47A接种本氏烟时，Y35β可以稳定复制，但其复制水平低于接种Y47A+Y47β的本氏烟中Y47β的复制水平，表明伴随同一辅助病毒时异源β卫星的复制水平低于同源β卫星的复制水平。将Y47A+Y47β+Y35A+Y35β的侵染性克隆接种本氏烟，观察症状发现，本氏烟在侵染早期症状较严重，表现出皱缩、向下卷叶、黄脉、曲茎、矮化、脉突等症状，但在侵染后期与Y35A+Y35β引起的症状相似，黄脉症状消失。特异性检测表明，在整个侵染过程中，在接种本氏烟中均可扩增到Y35A和Y35β的特异性条带，积累量总体呈上升趋势，并在接种后90d达到最高值。而Y47A和Y47β的积累量在侵染过程中呈下降趋势，接种120d后检测不到Y47β，接种180d后Y47A也丢失，说明Y47A/Y47β病害复合体和Y35A/Y35β病害复合体在同一寄主内复制时存在竞争。在不同组合接种本氏烟中，接种60d后Y47A的积累量从高到低依次为：Y47A+Y47β、Y47A+Y47β+Y35A+Y35β、Y47A+Y35β和Y47A，再次证明β卫星与同源辅助病毒之间的互作特异性比与异源辅助病毒之间特异性更强，辅助病毒将优先支持其同源β卫星的复制。关键词：赛葵黄脉病毒烟草曲茎病毒β卫星互作实时荧光定量PCRII AbstractTheinteractionbetweenMalvastrumyellowveinvirusandTobaccocurlyshootvirusassociatedwiththeirbetasatellitesAbstractPreviousstudieshavefoundthatbetasatelliteassociatedwithTomatoyellowleafcurlChinavirus(TYLCCNV)andTobaccocurlyshootvirus(TbCSV)canbetrans-replicatedbynon-cognatebegomoviruses,symptomsinducedbythetwovirusesweresignificantlydifferentwhenassociatedwithhomologousandheterologousbetasatellite,andtheaccumulationoftheviruswasnotdirectlyrelatedtotheseverityofthesymptoms.AfterinoculationwithTYLCCNVandTbCSVassociatedwiththeircognatebetasatellite,virusesandtheircognatebetasatellitearedetectableduringthewholeinfectionprocessinNicotianabenthamiana,TYLCCNVanditsbetasatellitearedetectablejustintheearlystageafterinoculationinN.glutinosa.Malvastrumyellowveinvirus(MaYVV)andTYLCCNVareofthesamepathogenictype,theircognatebetasatelliteisnecessaryfortypicalsymptomsinduction;TbCSVcaninfectplantsandinducetypicalsymptomswithoutbetasatellite.Inordertoclearifytheinteractionrelationsbetweenthetwokindsofpathogenictype,studywascarriedoutwithMaYVVY47isolate(Y47A),TbCSVY35isolate(Y35A),thebetasatelliteassociatedwithMaYVV(MaYVB)Y47（Y47β)andbetasatelliteassociatedwithTbCSV(TbCSB)Y35(Y35β)asthestudyobject,N.benthamianaasthehostplant.Real-timequantitativePCR(qPCR)detectionsystemwasestablishedusingspecificprimersdesignedbasedontheconservedsequenceofMaYVV,TbCSVandtheirbetasatellite,DNAextractedfromsampleleafandoptimized,thenthesensitivityandreproducibilityofthissystemwastested.Thestandardcurvewasestablishedbasedonthetemplatesofsevenconcentrationgradient(102-108copies/μL).Thestandardcurvecyclethresholdandtemplateconcentrationexhibitedgoodlinearrelationshipandamplificationefficiencywasbetween90%-110%.InqPCR,thecorrelationcoefficientofthestandardcurvewas0.998-1.000withintheamplificationefficiency,itshowedthatthesystemhasbetterdetectionperformance.Theminimumdetectionlimitofthissystemis10copies/μLofthetemplet,whichis100timesthesensitivitycomparedtothatofPCR.AfterinfectiouscloneofY47A,Y47A+Y47βandY47A+Y35βinfectingN.benthamiana,nosymptomwasinducedbyY47Ainfection.TheplantsinoculatedIII 西南大学硕士学位论文withY47A+Y47βperformeddownwardleafrolling,leafshrinkingandyellowveinsymptoms,whereastheplantsinoculatedwithY47A+Y35βperformedseriousstemdistortionanddwarf,andnosymptomofyellowveinorleafshrinkingwasobserved.TheinfectionrateofY47A+Y47βinN.benthamianawas100%whileY47A+Y35βwas72.7%,andthetimethatsymptomsdisplayedonN.benthamianainoculatedwithY47A+Y47β(4d)wasearlierthanthoseinoculatedwithY47A+Y35β.TheqPCRresultsindicatedtheaccumulationofY47AinN.benthamianainoculatedwithY47A+Y47βandY47A+Y35βwashigherthanthatinoculatedwithY47Aalone.TheseresultsshowedthatbetasatellitehelpedtoincreasetheY47Aaccumulation.WhenY35βandY47Awereco-inoculatedN.benthamiana,Y35βreplicatedstably,butitsreplicationlevelislowerthanthatofY47βintheN.benthamianainoculatedwithY47A+Y47β.Theseresultsshowedalowerreplicationlevelofbetasatellitewhenassociatedwithnon-cognatehelpervirus.TheinfectiousclonecombinationofY47A+Y47β+Y35A+Y35βwasusedtoinoculateN.benthamiana.Weobservedthesymptomswereseriousintheearlystageasshrinking,downwardleafrolling,yellowvein,distortedstem,dwarfingandenation,butyellowveinsymptomdisappearedinthelatestage.SpecificPCRdetectionshowedthatY35AandY35βincreasinglyaccumulatedduringtheinfectionwithapeakonthe90thdaypostinoculation(dpi).However,Y47AandY47βdecreasinglyaccumulatedduringtheprocess,Y47Awasundetectablein180dpiandY47βwasundetectablein120dpi.ItindicatesthatthediseasecomplexofY47A/Y47βandY35A/Y35βarecompetingfortheresourcesofthehostreplicationsystem.TheaccumulationofY47ArankfromhightolowindifferentinoculatedN.benthamianaat60dpiareasfollows:Y47A+Y47β,Y47A+Y47β,Y35A+Y35β,Y47A+Y35βandY47A,whichfurtherconfirmedthebetasatellitehasastrongerspecificinteractionwithitscognatebegomovirusthanthatwithanon-cognatebegomovirus,andbegomoviruspreferentiallytransreplicateitscognatebetasatellite.Keywords:Malvastrumyellowveinvirus;Tobaccocurlyshootvirus;betasatellite;interaction;Real-timefluorescencequantitativePCRIV 第一章文献综述第一章文献综述1双生病毒简介1.1双生病毒的分布及危害双生病毒科（Geminiviridae）病毒是一类具有孪生颗粒形态的植物单链DNA病毒，于1977年由Harrison等首次报道[1]，共包含200多个病毒种，是仅次于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)的第二大植物病毒科[2]。近年来，随着全球气候变暖、国际贸易往来日益频繁、农业耕作制度的变更，以及外来物种远距离入侵的机会不断增加[3]，导致双生病毒在包括东亚、南亚、地中海盆地、非洲、美洲及加勒比海等地区大面积爆发[4-9]，并严重危害烟草、棉花、番茄、木薯等在内的多种重要经济作物，对粮食生产和农业经济发展造成巨大损失[10]。“Science”也在1999年12月以“Geminivirusesemergeasseriouscropthreat”为题专门报道了这类病毒[11]。早在1965年，我国就已对广东番茄上的粉虱传播病毒病危害做了相关报道[12]。目前我国西南、华南、华东、华北地区的多个省份的番茄、烟草、番木瓜、南瓜等作物以及胜红蓟、赛葵等杂草都发现受到双生病毒侵染，其引起的病害呈扩展蔓延和逐年加重的趋势[13-17]。目前我国还未有因双生病毒危害而造成经济损失的具体统计数据，但在广西、广东、云南、贵州、福建、海南、浙江、上海、江苏、河北、北京、山东、河南及辽宁等地都有报道双生病毒侵染番木瓜、烟草、番茄等作物，且有的地区发病面积较大，危害严重。如由双生病毒侵染引起的云南烟草曲叶病害，在局部田块病株率可高达70％，使得烟草产量及质量严重下降；在广西及广东的番茄和番木瓜上，双生病毒发生普遍，多种双生病毒并存，使发病严重地区病株率高达30％-50％，有些田块甚至100％染病，对农业生产造成严重威胁[17-22]。又如云南元谋，番茄黄化曲叶病发病严重，造成番茄植株严重矮缩、花期延迟、叶片卷曲、果实减产、品质降低，发病率高达90％，严重时甚至绝收，经济损失极其严重。据不完全统计，我国番茄黄化曲叶病的年发生面积超过100万亩，年经济损失至少20亿元人民币。1.2病原致病性研究双生病毒基于基因组的结构、寄主范围、昆虫介体以及序列相关性进行分类。根据2013年国际病毒分类委员会(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV)发布的第九版分类报告，将双生病毒在原有4个属的基础上，即菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)、玉米线条病毒属(Mastrevirus)、曲顶病毒属(Curtovirus)和1 西南大学硕士学位论文番茄伪曲顶病毒属(Topocuvirus)，新增加了3个病毒属，即甜菜曲顶病毒属(Becurtovirus)、芜菁曲顶病毒属(Turncurtovirus)和画眉草条纹病毒属(Eragrovirus)[23]。Begomovirus属病毒在自然条件下仅由烟粉虱传播[24]，也称为粉虱传双生病毒(whitefiy-transmittedgeminivirus,WTG)，该属病毒由于寄主范围广，危害严重，因此是双生病毒科中危害最重以及数量最多的一个属。Begomoviruses基因组大多数包含两条大小、长度接近的2.5-2.8kb的单链环状DNA组份，称DNA-A和DNA-B。另外一部分begomoviruses为单组份双生病毒，含有1条大小为2.5-3.0kb的基因组，它的基因组结构非常类似于双组分双生病毒中的DNA-A组分；而近年来研究发现，大部分单组份begomoviruses在田间伴随一类卫星DNA分子，称为betasatellite（β卫星），该β卫星与辅助病毒复合侵染引起的复合体病害通常会对作物造成毁灭性的危害[25-27]。DNA-A共编码6个开放阅读框（OpenReadingFrame，ORF）。其中在互补链上包含4个ORFs(AC1、AC2、AC3和AC4)：AC1编码复制相关蛋白(Replication-assoeiatedprotein,Rep)，该蛋白具有ATP酶活性、DNA内切酶、解旋酶及DNA连接酶活性，参与病毒DNA的复制起始[28]；AC2编码一个转录激活蛋白(Transcdptionalactivatorprotein,TrAP)，该蛋白与调节病毒链上各基因转录功能有关，可调节CP的积累，也有研究表明AC2蛋白是转录后基因沉默抑制子[29]；AC3编码一个复制增强蛋白(Replicationenhanceprotein,REn)，该蛋白可与Rep蛋白结合从而增加病毒DNA的积累量；AC4嵌于AC1中，编码的蛋白与病毒的复制或转录调控有关，也与病毒的运动及寄主症状形成有关[30]。在病毒链上的2个ORFs(AV1和AV2)：AV1编码一个病毒外壳蛋白(Coatprotein,CP)，该蛋白是烟粉虱传播所必须的，主要决定病毒粒子结构，参与病毒包装，与系统侵染和与寄主互作相关[31]；AV2编码一个CP的前体蛋白，与病毒的运动有关[32]。这些ORFs被一段约200bp的保守的基因间隔区(Intergenicregion,IR)分开。该区含有病毒复制和转录必须的结构域和茎环结构顶端保守的9核苷酸序列(TAATATT/AC)[33]。单组份begomoviruses致病性依据其是否需要伴随卫星分子分为3类：第一类含有β卫星，病毒DNA-A单独侵染即可完成致病性。此类begomoviruses是不含有伴随β卫星分子的真正的单组份病毒，如番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV）[34,35]等，单独接种DNA-A组份的侵染性克隆足以诱导寄主植物产生典型症状，且病毒后代可以被烟粉虱传播。通过农杆菌介导的植物接种试验可知，TYLCV的侵染性克隆在番茄、本氏烟寄主上表现出极强的致2 第一章文献综述病性[34]。结果表明，TYLCV等未含有β卫星的单组份双生病毒单独侵染即可完成致病性。第二类伴随有β卫星，辅助病毒与β卫星共同完成致病性。此类病毒伴随β卫星分子，且伴随β卫星为病毒诱导寄主植物产生典型症状决定因子。如胜红蓟黄脉病毒(Ageraturnyellowveinvirus,AYVV)、中国番茄黄化曲叶病毒（TomatoyellowcurlleafChinavirus,TYLCCNV）、赛葵黄脉病毒（Malvastrumyellowveinvirus,MYVV）等单组份双生病毒DNA-A的侵染性克隆单独接种可以侵染胜红蓟、烟草和棉花等自然寄主和系统扩散，但不能诱导典型症状，只有伴随β卫星分子侵染性克隆共同接种时，引起植株曲叶、黄化、皱缩、耳突、叶脉增厚和植株矮化等双生病毒典型症状[13,14,36]。对TYLCCNV的致病性测定结果发现，TYLCCNV可单独侵染番茄、本氏烟和矮牵牛，但不产生典型症状，只有当TYLCCNV伴随β卫星存在的情况下，才能在番茄、本氏烟、赛葵和矮牛等寄主上引起典型症状，同时还发现，TYLCCNV可支持异源β卫星在本氏烟中复制、转录和移动，且症状产生的严重程度与寄主体内病毒的复制量正相关[37]。第三类伴随有β卫星，但辅助病毒诱导典型症状不依赖于β卫星分子。在有些单组份双生病毒中，仅部分分离物含有β卫星分子，而部分分离物不含有β卫星分子，如云南赛葵黄脉病毒（MalvastrumyellowveinYunnanvirus,MYVYNV）[38]、烟草曲茎病毒(Tobaccocurlyshootvirus,TbCSV)[39]等，其田间以病害复合体的形式感染率不高，约三分之一的MYVVNV田间分离物伴随有β卫星。MYVVNV与伴随β卫星形成的病害复合体在病毒致病性、β卫星与辅助病毒的伴随关系及调控症状的作用等方面均与其它双生病毒病害复合体不同[39]。侵染性测定表明，将MYVVNV的β卫星与DNA-A的侵染性克隆共同接种烟草时可引起叶片下卷和扭曲等症状，与田间烟草表现的典型症状一致，表明β卫星不仅与MYVVNV诱导症状形成相关，还可加重辅助病毒引起的症状[38]。表明，病毒伴随β卫星，但β卫星并不是病毒致病所必需因子。2双生病毒与小分子DNA形成的病害复合体1999年，Mansoor等从田间棉花曲叶病株提取的CLCuMV病毒粒子中发现了与棉花曲叶病（Cottonleafcurldisease,CLCuD）相关的类似卫星的单链环状DNA分子，称为DNA1，现称为alphasatellite（α卫星）[7]。随后，从棉花曲叶病、秋葵曲叶病、胜红蓟黄脉病、木薯花叶病、番茄黄曲叶病、烟草曲茎病、大乾花叶病、3 西南大学硕士学位论文白花菜皱叶病以及马铃薯曲叶病病株中都分离到了α卫星[40-47]。Briddon等发现α卫星总是与begomovirus/β卫星复合体相伴随，形成一类新致病类型——双生病毒病害复合体(geminivirusdiseasecomplex)。这种病害复合体广泛分布在非洲、中国、澳大利亚和印度，并且其危害有逐年扩大的趋势。2.1MYVV/MYVΒ及TbCSV/TbCSΒ病害复合体研究进展MYVV[48]和TbCSV[49]均为我国云南发现的双生病毒科（Geminivirade）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）的新种。MYVV可经粉虱和嫁接传播，是广西、云南、四川等省赛葵黄脉病的主要病原。TbCSV也能被烟粉虱成功传播到健康植株[50]，是云南烟草曲叶病的主要病原[51]。MYVV及TbCSV均为单组分begomoviruses，不含有DNA-B组分。其DNA-A全长约2.7kb，共编码6个ORFs，其中病毒链编码2个ORFs，AV1和AV2，互补链编码4个ORFs，AC1、AC2、AC3和AC4。在DNA-A的AC1和AV2之间有一个较长的非编码区（IR），其内含有保守的九核苷酸序列TAATATTAC以及TATAbox，还有重复序列CAATCGGG和GGGTCG等[51,52]。β卫星大小约为辅助病毒的一半（β卫星的基因组大小约为1.3kb)，所有的β卫星序列在复制起始原点都存在一段长度大约为100bp左右的保守的区域，被称为卫星保守区(satelliteconservedregion,SCR)。β卫星的SCR含有高度保守的序列，除了该9nt序列外，其他序列与其辅助病毒基本无同源性，才使得β卫星能被辅助病毒的复制蛋白所识别而得以复制[13]。侵染性测定结果表明，单独接种MYVV可侵染寄主和系统扩散，但观察不到双生病毒侵染引起的典型症状；只有当共同接种病毒和卫星MYVB时才能观察到典型症状，表明MYVB为辅助病毒诱导寄主产生典型症状的必需因子。且在田间样品检测中发现侵染了MYVV的植株普遍伴随MYVB[53]。对云南分离的TbCSV的研究表明，TbCSV单独接种可以在所有已知的寄主植物上诱导产生症状，其病毒本身足以在田间维持病害的发生，是一个不完全依赖卫星的病毒。TbCSV伴随的β卫星尽管能够加重辅助病毒诱导的症状，但对于辅助病毒的侵染效率、发病时间及核酸积累水平均没有明显的影响。与其它的双生病毒病害复合体相比，TbCSV与β卫星的联系较为松散，特别是在番茄植株中伴随辅助病毒的β卫星会逐渐丢失，而田间发现仅有部分TbCSV分离物伴随β卫星，且番茄样品中未检测到β卫星的存在[30]。这些结果表明，TbCSV很可能是一个在进化中处于双生病毒病害复合体和真正的单组份双生病毒之间的过渡类型[54]。4 第一章文献综述2.2双生病毒病害复合体各组分之间的互作在begomovirus/β卫星病害复合体中,begomovirus与伴随的β卫星相互依赖，β卫星包裹在其辅助病毒编码的外壳蛋白中，需依赖其辅助病毒完成复制，通过病毒的移动随之在植株体内系统移动，并借助粉虱介体在植株之间传播，反之辅助病毒基因组的复制水平及引起典型症状的水平又受到β卫星分子的调控，且病害复合体各组分间能够发生不同程度的互作[55]。青玲等[37]研究发现，TbCSV和TYLCCNV伴随β卫星均能改变辅助病毒引起的症状，并可被异源辅助病毒稳定复制，无论TYLCCNV还是TbCSV伴随同源或异源β卫星时引起的症状均不同，表明症状差异是由β卫星引起的，进一步证明β卫星与症状调节有关，并且当辅助病毒伴随同源或异源β卫星时，其辅助病毒的积累水平也不同，表明不同双生病毒与卫星分子之间的互作机制不同[55]。所有的β卫星都包含一个大小、位置和氨基酸序列都相对保守的编码区，为βC1基因。研究表明，表达βC1的转基因植物能够引起供试植株产生类似病毒感染的症状，但βC1突变的β卫星与辅助病毒共同接种，则不再诱导产生典型的病害症状，这说明βC1在决定病害复合体的症状类型时起重要作用[56]。同时，βC1还可以抑制寄主的茉莉酸信号转导途径，并且与甲基循环中关键的酶S-腺苷高半胍氨酸水[57，58]解酶(SAHH)互作，从而抑制甲基化介导的转录水平基因沉默，这说明βC1蛋白在决定病害复合体的症状范围时起重要作用。目前亚洲、非洲多个国家已发现多种begomovirus/β卫星病害复合体，其分布和寄主范围正在迅速扩展，危害日益严重[59-61]。β卫星除了是一个症状决定因子外，还能为病毒适应寄主提供更多的机会，因而，在自然环境中，如果β卫星一旦被异源的双生病毒捕获并形成新的病害复合体可能会使病害加重，或侵染原来辅助病毒不能侵染的寄主植物，从而扩大其寄主范围或导致一些抗病品种的抗性丧失而引起新的病害，。烟草上普遍存在复合侵染情况和病毒重组的现象，比如，在广西部分烟区有云南辣椒曲叶病毒（PepperleafcurlYunnanvirus,PepLCYNV）、中国番茄曲叶病毒（ToLCCNV）及中国番茄黄化曲叶病毒（TYLCCNV）的重组病毒[62]，在云南发现TbCSV+TbLCYNV、TbCSV+TYLCCNV和TbCSV+TbLYNV+TYLCCNV的复合侵染[63]。近年来，双生病毒引起的病害有越来越严重的趋势，这将对农业生产构成巨大威胁，巴基斯坦棉花曲叶病爆发和流行就是一个典型的例子[59]。因此了解双生病毒的复合侵染中各组分间的相互作用，5 西南大学硕士学位论文为有效控制我国双生病毒的危害打下理论基础，因此β卫星与双生病毒的互作值得高度关注。3病毒间的相互作用在自然的状态下，植物病毒间复合侵染发生普遍，且病毒复合侵染有多种作用方式，包括协生作用和干扰作用等。3.1协生作用协生作用是指两种异源病毒相互作用时，产生比其中任何一种病毒单独侵染更加严重的症状，以及被侵染组织通常表现出至少一种病毒积累量的增加[64]。协生作用在自然界广泛存在，是导致农作物减产甚至绝收的重要原因。最早在1925年首次报道关于两种病毒的协生作用，直到1995年报道关于马铃薯X病毒（PotatovirusX，PVX）和马铃薯Y病毒（PotatovirusY,PVY）的协生作用，才使人们对病毒协生作用有了初步认识。在已报到的协生作用中，绝大多数是由马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒介导的，促进与之复合侵染的病毒积累水平或侵染能力增强[65]。协生作用多发生在亲缘关系较远的两种病毒之间，但也有同属病毒之间发生协生作用，如辣椒金色花叶病毒(Peppergoldenmosaicvirus,PepGMV)和瓦斯蒂克辣椒病毒(Pepperhuastecovirus,PHV)之间的协生作用[66]。植物病毒的协生作用中，至少会有一种病毒的积累水平提高[67]，而且能改变病毒的致病性，使激发病毒增强被协生病毒的致病性，但协生病毒本身的致病性不变甚至下降。如烟草蚀纹病毒（Tobaccoetchpotyvirus,TEV)/烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus,TMV）、TEV/黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）的协生作用中，TEV提高了TMV、CMV的致病性，而TEV的致病性却无变化[64]。甘薯品种Tanzania对甘薯羽状斑驳病毒(Sweetpotatofeatherymottlevirus,SPFMV)的抗病性表现为病毒含量极低，无症状；当SPFMV与甘薯褪绿矮化病毒(Sweetpotatochloroticstuntvirus,SPCSV)同时侵染Tanzania时，甘薯中SPFMV病毒粒子的浓度提高了600倍[68]。而Potyvirus通常作为激发病毒促进被协生病毒的复制，而其本身的复制水平稍有降低[69]。在植物病毒的协生作用中，其作用的显著特点表现为加重病害症状，导致新病害的出现和流行[70]。例1997年由于两种双生病毒的复合感染，导致非洲木薯花叶病在乌干达大流行，严重的限制了木薯的生产[70]。又如马铃薯退化病、玉米致死性坏死病等病害也均由病毒协生作用所致[71,72]，其中玉米致死性坏死病曾使美国堪萨斯州的玉米减产了90％，一度制约6 第一章文献综述玉米的生产[71]。菜豆荚斑驳病毒(Beanpodmottlevirus,BPMV)和大豆花叶病毒(Soybeanmosaicvirus,SMV)能复合侵染大豆，造成大豆顶枯病[73]。协生作用还使寄主丧失抗病性，扩大病毒的寄主范围。玉米品种H84和N28是抗小麦线条花叶病毒(Wheatstreakmosaicvirus,WSMV)，当玉米褪绿斑驳病毒(Maizechloroticmottlevirus,MCMV)或玉米矮花叶病毒(Maizedwarfmosaicvirus,MDMV)与WSMV共同侵染时，WSMV则能够克服寄主的抗性使其侵染率提高，WSMW的浓度可提高2-3倍[71]。PVY单独接种植物时检测不到PVY，但当PSTVd或TMV存在时，PVY能够侵染且病毒含量很高[74]。协生作用的分子机理主要从病毒的复制、运输及病毒与寄主的互作三方面解释：在大多数植物病毒协生作用中，总是表现为协生病毒提高被协生病毒的复制水平或两种病毒可相互促进其复制水平[64,68,69,74]；在寄主中不同种属植物病毒的MP可以介导被协生病毒的系统运输和协生作用[68,75-77]，且在转基因植物中表达的MP同样能够介导病毒间的协生作用[75,78]；在病毒与植物长期的共同进化过程中，寄主逐渐形成了许多限制病毒侵染的障碍，而协生病毒与寄主因子相互作用而破坏寄主的防御系统后，协生病毒再与被协生病毒作用，从而影响被协生病毒的复制水平或移动[79]。3.2干扰作用干扰作用是指先入侵的第一种病毒能够保护寄主抑制后接种的病毒的增殖，即两者之间发生了干扰。干扰作用经常出现在同种病毒的相关株系或近缘病毒之间，而这种作用随着其亲缘关系越近则越强[80]。干扰作用主要有以下几方面的表现：(1)症状减轻或者不发病。烟草感染了烟草花叶病毒(TMV)的绿色花叶株系后，在接种黄色株系就不产生黄色株系的症状。经弱毒株免疫的植株再感染与弱毒病毒相关的强毒病毒时通常症状较轻，甚至不表现症状。(2)保护病毒限制攻击病毒的移动。用保护病毒接种植株后再用强毒株攻击，发现攻击病毒在接种叶中不能积累，因而在系统叶中也检测不到。例如在美国小麦上分离的两个关系较近的小麦线条花叶病毒(WSMV)株系中，两个株系具有明显的交叉保护作用，经研究发现，这两个株系在不同植株或同一植株的不同部位分布不均[81]。目前这方面的研究并不多没有得出一定的结论。(3)延迟植株发病的时间。研究发现，马铃薯纺锤块茎类病毒（Potatospindietuberviroid,PSTVd）的强毒株(S-PSTVd)单独侵染，21-28d可在植株观察到症状，而在受弱毒菌株(MA-PSTVd)接种植株上，再接种该7 西南大学硕士学位论文病毒的强毒株(S-PSTVd)，则在接毒后48d后才可观察到由强毒株(S-PSTVd)引起的症状[82]。(4)保护病毒抑制攻击病毒的复制。例如在辣椒上分离到的两个CMV分离物(CMV-SD2和CMV-35)中，CMV-S可保护辣椒植株不受CMV-35的侵染，且植株检测不到CMV-35，经RNA酶保护分析证明，这是由于保护病毒抑制了攻击病毒的复制所致[83]。目前有关植物病毒株系间的干扰作用的详细机理还不是很清楚，但许多学者对这种干扰作用的机理提出了各种假说：保护病毒先侵入占有或用去寄主的某些代谢产物和结构，而攻击病毒的成功侵染必须依靠这些代谢产物和结构，从而使攻击病毒无法侵染；保护病毒在自身复制过程中破坏了复制所需要的细胞染色体成份，从而抑制后感染的攻击病毒的复制；保护病毒的外壳蛋白抑制攻击病毒基因组的脱壳和释放，或者外壳蛋白分子将后感染的攻击病毒核酸分子包装起来，使其失去复制的能力从而干扰了攻击株的复制；保护病毒的RNA通过与攻击病毒的RNA发生分子杂交从而抑制后者的表达；保护病毒的存在妨碍攻击病毒在细胞间的运动；保护病毒的复制激活寄主的防御机制，由此降解攻击病毒的RNA；保护株CP能够包裹攻击株的RNA使得其难以表达；通过竞争病毒复制中可能利用的病毒复制酶和复制位点来阻止后侵入的病毒的复制；与动物中的免疫机理一样，植株受弱毒株系感染后，在体内产生了类似的免疫球蛋白，而使植株免受强毒株再感染而得到保护；两种病毒的复制中可能存在相互抑制作用；保护病毒的存在妨碍攻击病毒的系统运动[84-86]。近年来则更倾向于RNA沉默机理，研究发现植物的防卫反应机制与具有特定序列dsRNA介导的RNA降解反应有关，预先接种的病毒的侵染引发RNA沉默，降解具有较高同源性序列的攻击病毒RNA[87]。4实时荧光定量PCR技术在植物病毒中的检测应用1985年出现聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)技术，该技术经过预变性、变性、退火、延伸，可扩增特定的目的片段，可以对结果进行定性、定量的分析，在分子生物学等研究领域得到了广泛的应用。但如果DNA初始模板量太低而不被PCR信号扩增放大，则有可能出现扩增假阴性[88,89]。实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR,qPCR)是在定性PCR技术的基础上，把特定的荧光基团加入到PCR反应体系中,以随着扩增阶段发出的荧光信号来实时监控整个PCR进程，通过荧光强度与PCR扩增产物的关系进行定量分析的方法[90]。实时荧光定量PCR的最初由Higuchi于1992年提出的[88]，几年后，由美国Applied8 第一章文献综述Biosystems公司推出实时荧光定量PCR技术后，使这种高效、精确的技术市场化并开始得到广泛应用。比起常规PCR,实时荧光定量PCR在在反应结束后不需要再进行电泳检测等步骤，自动化程度高,克服了常规PCR会污染引起假阳性和不能准确的定量的问题,同时做到了边扩增边检测。目前实时荧光定量PCR已经成为了一个分子生物学研究常用的实验方法。4.1实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR技术的原理是在PCR反应体系中加入一种荧光化学标记基团，随着PCR扩增反应的进行，PCR扩增产物不断累积，荧光强度也呈比例增加。每一个PCR循环结束后，收集荧光物质信号，仪器就通过荧光强度变化和PCR扩增产物量间关系，从而得到一条荧光扩增曲线图。一条荧光扩增曲线通常可以分成三个阶段：荧光背景信号扩增阶段、荧光信号指数扩增阶段和后期平台期。在荧光背景信号扩增阶段，以背景荧光信号为特征，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，仪器无法准确定量扩增产物的荧光值，但该时期的每个循环周期产物的荧光信号都会积累下来，直到超出背景荧光信号的范围。而在反应进入平台期，因反应体系消耗使扩增产物与起始DNA模板量之间不存在线性关系，所以平台期也无法定量分析。只有在荧光信号指数扩增阶段，荧光信号的强度呈现比例增加随着扩增产物的增加，PCR扩增产物量与起始DNA模板量之间存在线性关系，因此，荧光定量检测分析就在此阶段。为帮助进行结果分析引入荧光阈值和CT值两个重要概念。荧光阈值是指在实时荧光定量PCR反应的指数扩增阶段，人为的设定一定的荧光信号的域值，一般以实时荧光定量PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，阈值设置为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的十倍。CT值(CycleThreshold，CT)指当荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。相关实验数据表明，不同样品模板的实时荧光定量PCR扩增曲线的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在的线性关系，初始模板浓度越低，CT值越大，反之，CT值越小。可通过模板标准品作出标准曲[91，92]线，得到未知样品的CT值可从标准曲线上计算出待测样品的起始拷贝数。4.2实时荧光定量PCR的特点实时荧光定量PCR跟普通的PCR相比，其线性范围很宽，且实时荧光定量PCR的敏感性达10Ncopies/μL，其灵敏度要比常规PCR高10-100倍，实时荧光定量PCR技术与计算机技术结合，有效减少了劳动量，可检测到单拷贝基因，敏感性大大9 西南大学硕士学位论文提升，而传统PCR难以达到。实时荧光定量PCR技术因其运用引物和探针的双重特异性，使其与常规的PCR相比，特异性大为提高，实时荧光定量PCR在全封闭状态下实现体系扩增及产物分析，有效的减少人体的伤害，同时降低了产物污染的风险性。实时荧光定量PCR结果相当稳定，即使同一标本的CT值相同，其扩增产物的荧光强度却相差很大，因在指数期，每一轮循环均积累一次荧光信号的强度，使CT值与荧光信号的对数呈线性关系，有效地解决了常规PCR只能终点检测的局限。根据反应中的化学原理的不同，实时荧光定量PCR通常有探针法和染料法两种。荧光探针法是一种利用序列特异性的检测技术，通过在PCR反应体系中加入一个特异性的荧光染料标记的特寡核苷酸探针来检测产物。该探针两端分别标记一个淬灭基团(Q)和一个荧光基团(R)。当探针与靶标模板结合时，R基团发射的荧光因与Q基团接近而被淬灭。PCR扩增时，每扩增一条DNA链，就被酶剪切一条探针，每剪切一条探针，就有一个荧光信号形成，信号强度与结合探针的DNA分子数成正比，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。杂交探针在PCR扩增中不被水解，而是通过探针与靶序列的杂交来改变荧光基团和淬灭基团的距离，从而[93，94]释放荧光信号。染料法利用荧光染料来指示扩增产物的增加。应用最为普遍的荧光染料是SYBRGreenI，SYBRGreenI是一种特异亲和双链DNA发出荧光而不与单链DNA结合的染料，因此在变性阶段荧光强度最低，而当单链DNA合成双链DNA时，SYBRGreenI就会随之特异结合到双链DNA上，此阶段的荧光信号强度增强，在延伸阶段的末期，所有的DNA均是双链的，结合双链DNA的SYBRGreenI含量达到最大值，该反应体系中的荧光信号也达到最大值，一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA量成正比例，而没有掺入DNA双链中的SYBRGreenI分子则不会发射任何荧光信号，这个时候就可以用仪器测定SYBRGreenI发出的荧光进行定量分析。在PCR反应体系中，—般将过量SYBRGreenI和水，dNTPs，缓冲液，TaqDNA聚合酶，引物和模板一起加到扩增反应管中，即可以进行反应[95]。4.3实时荧光定量PCR的数据分析运用实时荧光定量PCR技术可以对DNA、RNA样品进行定量分析。定量分析包括相对定量分析和绝对定量分析。绝对定量指的是用已知的标准品制作一条标准曲线，通过标准曲线来推算未知样本的量。以标准品稀释成不同梯度的样品10 第一章文献综述作为模板进行PCR反应，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以各个梯度的CT值为纵坐标，得到一条标准曲线。该方法的优点就是结果可直接通过软件得出不需额外计算，可以准确读出目标片段的拷贝数。此方法合适的标准品是定量准确的关键，要求标准品的定量必须准确并且标准品与未知样本应具有一致的扩增效率。所以要求不应含有影响定量的因素，标准品纯度要高，未知样本和标准品各自反应体系内的干扰因素要一致等，在试验的操作过程中，每次都要制作标准曲线，而且标准曲线的使用的样品数比较多，稍微的操作不慎就有可能产生假阳性[96]。相对定量则是选定一段内源参照基因序列，在同一条件下对样品靶序列和内参序列进行扩增，通过比较两种序列的扩增量来对样品靶序列进行定量分析。相对定量有两种方法：标准曲线法和值比较法。如果使用标准曲线法，并不需要知道制备标准曲线的标准品的准确浓度，只需要标准品与待测样品之间的相对稀释度，比起绝对定量来说标准曲线的制备要简单一些。为了更加确定实验中的相对定量结果，普遍会在待测品和参照样品扩增反应体系内都加入内参基因同时扩增。比较CT值法是靶基因与内参基因的相对量是以数学公式计算得来的，该方法需要假设靶基因和内参基因的扩增效率是基本一致的，需要获得PCR扩增的指数阶段的CT值，假设每个反应循环过后扩增都增加一倍，从而利用CT值来反应靶基因和内参基因起始的量，一个CT值的差异则相当于起始模板数2倍的差异。故在相对定量时需要考虑反应试剂、扩增效率的差异对实际拷贝数的影响。相对定量可以避免绝对定量中标准品定量时的误差对定量结果造成的影响，相对定量比绝对定量更加简单、更加普遍，通过对检测目的基因与内参基因的表达量的变化来实现的[97]。4.4实时荧光定量PCR的应用实时荧光定量PCR技术可对DNA、RNA样品进行定性和定量分析，是分子生物技术的一次飞跃。实时荧光定量PCR技术在植物病毒定性、定量研究方面也发挥着越来越重要的作用，此技术大大提高了植物病害的检测水平。郭立新等人根据苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus,ASGV)不同分离物CP基因的保守序列，设计并合成检测特异性引物和TaqMan探针，建立起ASGV实时荧光定量RT-PCR检测方法，该方法的灵敏度是常规RT-PCR的10倍，适用于在植株体内含量较低的ASGV的快速检测[98]。有研究应用实时荧光定量PCR技术在洋桔梗植株上检测到鸢11 西南大学硕士学位论文尾黄斑病毒(Irisyellowspotvirus,IYSV)，这是鸢尾黄斑病毒侵染洋桔梗的首次报道[99]。实时荧光定量PCR不仅能对植物病毒进行定性检测，还能通过绝对定量或者相对定量的方法达到对植物病毒的定量分析。高雅红等人根据李痘病毒(Plumpoxvirus,PPV)的CP基因序列保守区域，设计并合成特异性引物和TaqMan探针，建立起基于TaqMan探针的李痘病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法，该方法具有较强的特异性，还可以准确定量PPV，其对PPV最低检测1.6×l02copies/μL[100]。Maher等人建立了花椰菜花叶病毒（Cauliflowermosaicvirus,CaMV)的实时荧光定量PCR检测方法，该方法具有强特异性和高灵敏度的特点，对CaMV的最低检测限达到10copies/μL。目前实时荧光定量PCR技术在医学诊断、农业发展、分子生物学基础研究、军事、各种检验检疫等多个领域得到应用。12 第二章引言第二章引言粉虱传双生病毒(WTG)在分类上属双生病毒科(Geminiviridae)中的菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，是世界范围内广泛发生的一类具有孪生颗粒形态的植物环状单链DNA病毒，基因组大小在2.5-3.0kb左右，一般分为单组份和双组份结构。而近年来研究发现，大部分单组份begomoviruses在田间伴随一类卫星DNA分子，称为β卫星，其大小约为辅助病毒的一半，除了其茎环结构中保守的9碱基序列“TAATATT/AC”外，与其辅助病毒几乎没有同源性。β卫星分子必须依赖辅助病毒DNA组份进行复制，同时能被介体烟粉虱传播。β卫星分子不仅与病毒积累、致病性及症状诱导紧密相关，还可能对决定寄主范围有重要作用，其与辅助病毒复合侵染引起的复合体病害通常可对作物造成毁灭性危害。在我国发现的粉虱传双生病毒多数伴随β卫星分子，β卫星分子是双生病毒病害复合体的重要致病因子。赛葵黄脉病毒（MYVV）的分离物Y47A和烟草曲茎病毒（TbCSV）的分离物Y35均为单组份双生病毒并伴随β卫星分子，侵染性试验表明MYVV-Y47A可单独系统侵染但不能诱导明显的症状，但当与Y47β卫星分子共同侵染时则引起典型的黄脉、向下叶卷、脉突等症状，表明Y47β是Y47A诱导典型症状所必需的。伴随TbCSV的Y35β卫星分子尽管不是症状诱导所必需但在烟草植株上可增强Y35A引起症状的严重程度，表明β卫星分子与双生病毒致病性密切相关。已有研究表明，与MYVV同致病类型的TYLCCNV，伴随同源β卫星（TYLCCNB）或异源β卫星（TbCSB）时引起的症状均不同，表明症状差异是由β卫星引起的，进一步证明β卫星与症状调节有关。已知植物病毒在自然条件下复合侵染现象很普遍，而复合侵染的病毒之间常表现拮抗或协生的互相作用。本实验室前期研究中发现，在烟草和杂草上MYVV和TbCSV发生普遍且常常复合侵染，为了明确不同致病类型的病毒及β卫星之间的互作关系，本研究以MYVV和TbCSV及伴随β卫星为材料，进行了双生病毒及伴随β卫星病害复合体各组分之间的互作研究，利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术检测两种病毒及其β卫星在本氏烟中的积累量，探究各组分的相互关系，该研究结果可望为探索不同致病类型双生病毒的互作规律提供理论依据，对于双生病毒病害防控具有重要意义。13 西南大学硕士学位论文14 第三章两种双生病毒及其伴随β卫星实时荧光定量PCR体系的建立与优化第三章两种双生病毒及其伴随β卫星实时荧光定量PCR体系的建立与优化由于粉虱传双生病毒(WTG)的寄主种类多，可侵染烟草、番茄、南瓜、木薯、棉花等作物，在我国发生范围广泛，如云南、广西、广东、福建及四川等省市[17-19]，为了进一步了解该病害的发生分布及流行趋势，必须建立准确、灵敏、快速的检测手段。实时荧光定量PCR技术（qPCR）是近年来发展起来的新的检测方法，与常规PCR相比具有更高的灵敏度、特异性和稳定性，且能够对靶标序列进行定量分析，使得这一技术成为植物病毒的重要检测手段，尤其是对于受到病毒复合侵染的植株，可利用这一技术进行病毒复制量的比较分析。研究在实验条件下建立了检测MYVV、TbCSV的qPCR体系，为进一步研究病毒之间的互作机制奠定了基础。1实验材料1.1供试寄主植物本研究选用的供试寄主本氏烟(Nicotianabenthamiana)，种子由西南大学植物保护学院植物病毒实验室保存，实验植株于无虫光照温室中培养（25℃，16h光照/8h黑暗）。1.2病毒及卫星分子的侵染性克隆烟草曲茎病毒(TbCSV)Y35分离物(Y35A)及其伴随β卫星(Y35β)的侵染性克隆，赛葵黄脉病毒（MYVV）Y47分离物（Y47A）及伴随β卫星（Y47β）的侵染性克隆，均由浙江大学生物技术研究所周雪平教授惠赠。1.3试剂、菌株、酶和克隆载体等大肠杆菌EscherichiacoliDH5α，购自北京全式金生物技术有限公司；TaqDNA聚合酶、PrimerSTARDNA聚合酶购自Takara公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自TIANGEN公司；克隆载体PGEM-TEasy，SYBRGreenI荧光染料，购自Promega公司；常用生化试剂见附录B。1.4常用实验仪器本实验所用的PCR仪和实时荧光定量PCR仪购自Bio-Rad，分光光度计、冷冻离心机和常温离心机均为Eppendorf公司产品，凝胶成像仪购自GeneCompany15 西南大学硕士学位论文Limited公司，电泳仪购自北京六一公司。2实验方法2.1农杆菌介导的植株接种1）将保存于-80℃的含有的Y47A、Y47β和Y35A、Y35β侵染性克隆农杆菌（EHA105）分别划线接种于含硫酸卡那霉素（Kan）（50mg/mL）和硫酸链霉素（Sm）（50mg/mL）的YEP固体培养基平板上，30℃倒置培养1-2d得到单菌落；2）挑单菌落接种于5mL的YEP液体培养液（含Kan50mg/mL、Sm50mg/mL）中，30℃，120rpm过夜培养；3）将菌液按1：50的比例转接到50mL含有相应抗生素的培养液中，30℃，120rpm振荡培养至生长对数期（OD值0.6~0.8）；4）5000rpm离心5min收集菌液5）收集菌体用现配重悬液（MgCl210mmol/L，乙磺酸MES10mmol/L和乙酰丁香酮AS100mmol/L）悬浮沉淀菌体，调节重悬液至OD600=1.0左右；6）将配置好的侵染性克隆重悬液Y47A与Y47β、Y35A与Y35β等体积混匀；7）室温静置数小时（2~3h）进行接种。选取4~6叶龄期植株。用1mL一次性注射器，在距离根部1-2cm处取三点或在叶片背面选择两点进行注射接种，接种完成置于防虫网室内培养。2.2烟草总DNA的提取采用常规CTAB法提取烟草基因组DNA，步骤如下：1）取0.2g新鲜烟草叶片组织，于液氮中研磨至粉状；2）将研磨粉末迅速转入2mL预冷的离心管中，立即加入4倍体积预热的CTAB提取缓冲液（含2%巯基乙醇，w/v），温和混匀；3）65℃水浴60min，期间不时摇动离心管，使其充分混匀；4）7500rpm4℃离心10min，回收上清液；5）用等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒使其充分混匀，于4℃7500rpm离心10min，回收上清液；6）用等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提，混匀，离心，回收上清液；7）取上清液，加入0.7倍体积预冷的异丙醇和0.1倍体积NaAC（3M）混匀，-20℃放置30min；8）12,000rpm4℃离心10min小心弃掉上清液；16 第三章两种双生病毒及其伴随β卫星实时荧光定量PCR体系的建立与优化9）加入适量（一般600μL）75%乙醇洗涤沉淀（洗涤2次）；10）自然风干（或37℃烘干），加入适量ddH2O溶解，-20℃保存；11）取5μLDNA样品在1%琼脂糖凝胶电泳，初步检测提取DNA浓度、纯度和完整度。同时取2μL稀释50倍，测定OD260/OD280，测定DNA含量及质量。剩余DNA置于-20℃贮存备用。2.3PCR技术以所提取的植物总DNA为模板，根据GenBank中Y35的DNA-A及其Y35β的保守序列、Y47的DNA-A及其Y47β的保守序列，利用DNAMAN软件设计实时荧光定量PCR特异性引物TbCSV(Y35-qpcr-F/R)、TbCSB(Y35β-Q-F/R)、MYVV(Y47-qpcr-F/R)、MYVB(Y47β-Q-F/R)（表3.1），用NCBIPrimer-BLAST进行比对，保证引物的特异性。其反应体系及扩增条件如下:（1）取0.2mLPCR管，依次加入以下试剂，然后添加双蒸水至终体积为25μL。PremixExTaq，10mmol/L12.5μL上游引物，20mol/L1.0μL下游引物，20mol/L1.0μL模板DNA1.0μL加ddH2O至终体积25μL（2）反应条件参数设置：①94℃预变性2min后，开始以下循环：②94℃预变性45sX℃退火45s（X值视引物的Tm值而定）72℃延伸Ys(Y值视目的片段大小而定)③重复步骤②，30～35个循环；④72℃延伸10min；(3)反应结束后，取5μL电泳检测扩增结果表3.1PCR扩增所用引物序列Tab.3.1SequencesofprimersusedforPCRamplification引物引物序列（5’-3’）片段大小(bp)PrimersSequence(5’-3’)Productsize(bp)Y47-q-FGGGATCCACTTGTAAACGAG231Y47-q-RGCTGTCGAAGTTCAGACGAY47β-q-FACTGAAAAGGAAAGAAAACG169Y47β-q-RCGGGGGTATTTTTGGAAAGTY35-q-FGTCACCAAAGCAAGAGCA225Y35-q-RACCCAAGACATAAACGGAY35β-q-FTGGTCTCTTGTTGGGCTCTT185Y35β-q-RAGAAGCGGCTGTTGAGGATA17 西南大学硕士学位论文2.4PCR产物纯化PCR扩增片段用TIANGEN公司的DNA纯化试剂盒进行纯化回收。实验步骤参照其使用说明书，具体操作如下：1)柱平衡：向吸附柱CB2中加入500μL的平衡液BL，12,000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；2)向50μLDNA溶液中加入200μL的溶液PC，充分混匀；3)将上一步所得溶液加入吸附柱CB2中，室温放置3min，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附管放入收集管中；4)向吸附柱中加600μL漂洗液PC，静置几分钟后12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；5)再次加入600μL漂洗液PC洗柱，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；6)12000rpm空管离心2min去除壁上的液体，然后将CB2转移到灭菌的1.5mL离心管中，静置几分钟彻底晾干；7)向吸附柱管内加入50μLddH2O，室温静置2min，12,000rpm离心1min收集DNA。8)将DNA收集液重新加入吸附柱，重新过柱一次，增加DNA的回收量；9)取2μL用于1％的琼脂糖凝胶检测，其余的-20℃保存。2.5分子克隆2.5.1T-载体连接本实验所用T-A克隆载体PGEM-TeasyVector购自Promega公司，扩增片段T-A克隆连接反应体系如下：胶回收产物3-3.5μL线性化载体DNA0.5-1μL2×LigationBuffer5μL连接酶1μL加灭菌ddH2O至终体积为10μL，放置4℃，反应过夜。2.5.2转化1)取-80℃保存的感受态细胞（100μL/管），冰上融化；2)加入10μL连接产物（不超过感受态体积1/10），用枪头轻打混匀，冰浴30min；3)42℃热击90s后迅速置冰浴2-5min；4)加入800μL液体LB（无抗）培养基，37℃振荡培养1h；18 第三章两种双生病毒及其伴随β卫星实时荧光定量PCR体系的建立与优化5)将培养液常温3,500rpm离心5min；6)弃上清，取余下的100μL菌体吹打重悬，混匀后涂布于事先已涂布X-gal和IPTG的LB培养基(含100ug/mL氨卞青霉素)，37℃倒置培养约8h待菌体长出后4℃冰箱放置2h至蓝、白斑区分明显为止。2.5.3菌液PCR鉴定取2mL离心管加入1mL的液体LB培养液。用白色枪头轻轻醮取白斑，然后打入离心管中，编号，置37℃摇床200rpm-230rpm振荡培养数小时，使其生长至对数增长期。取菌液作为模板，进行PCR和电泳检测分析。PCR反应同本章2.3。2.6序列的测定与分析挑选菌液检测呈阳性的菌样，进行序列测定。序列测定委托北京六合华大基因科技有限公司。测得的序列通过BLAST(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)程序进行同源检索和相似性比较分析。2.7标准DNA样品的制备2.7.1质粒提取选取经测序确定正确的菌样，按1:100比例于摇菌管转接培养10mL，培养至OD[101]600为0.6～0.8，进行菌液质粒提取。操作步骤参照质粒提取试剂盒说明书，具体步骤如下：1）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12,000rpm（～13400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；2）取1-5ml过夜培养的菌液加入离心管中，12,000rpm（～13400×g）离心1min，尽量吸除上清（注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中，菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率）；3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液Pl（请先检查是否已加RNaseA)，移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀（注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低）；4）向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；5）向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，19 西南大学硕士学位论文此时会出现白色絮状沉淀。12,000rpm（～13400×g）离心10min，此时在离心管底部形成沉淀；6）将上一步收集的上清液用移液器移到吸附柱CP3（吸附柱放入收集管中）,注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm（～13400×g）离心36-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；7）向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（～13400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；8）重复操作步骤7；9）将吸附柱CP3重新放回收集管中置于12,000rpm（～13400×g）离心2min（目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应实验，如酶切、PCR等。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP4开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液）；10）将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm（～13400×g）离心lmin将质粒溶液收集到离心管中。2.7.2拷贝数的计算取1μL上一步提取的质粒稀释50倍，用分光光度计检测其浓度，然后用以下公式计算提取质粒单位体积的拷贝数。拷贝数（copies/μL）=6.02×1023(copies/μL)×质粒浓度(g/μL)×稀释倍数/质量MW(g/mol)其中：MW=[载体碱基数(bp)+目标片段碱基数(bp)]×660D/bp。2.8qPCR条件的优化和标准曲线的建立2.8.1退火温度的优化将质粒DNA调节至（106copies/μL）作为模板，引物稀释至500nmol/μL，进行实时荧光定量梯度PCR优化，退火温度从53-63℃，检测不同梯度退火温度下qPCR的扩增效果，选取CT值最小且扩增曲线最好的温度作为后续试验反应温度[102]。2.8.2引物浓度的优化设置质粒DNA拷贝数梯度（109-10copies/μL）作为模板。同时将引物稀释成20 第三章两种双生病毒及其伴随β卫星实时荧光定量PCR体系的建立与优化浓度梯度（800、600、500、400、300、200nmol/μL），进行qPCR反应，观察不同的引物稀释浓度下标准曲线的扩增效率[103]。2.8.3标准曲线的建立将标准品DNA稀释7个浓度梯度（108-102copies/μL）作为模板，用上述优化的最佳qPCR退火温度和引物浓度进行反应。每个处理设定3个重复，同时设定空白对照、阳性对照和阴性对照，由仪器自动生成标准曲线。2.8.4qPCR的特异性试验选取4种常报道的双生病毒TYLCCNV、中国番木瓜曲叶病毒(PapayaleafcurlChinavirus,PaLCuCNV)、云南烟草曲叶病毒(TobaccoleafcurlYunnanvirus,TbLCYNV)、胜红蓟黄脉病毒(Ageratumyellowveinvirus,AYVV)，以及TbSCV和MYVV的DNA样品，稀释至相同浓度，分别用设计的TbSCV和MYVV引物进行扩增qPCR反应，同时设定阴性对照，观察设计的TbSCV和MYVV引物能否扩增出选取的4种病毒，从而评价该引物的特异性。2.8.5qPCR的灵敏性试验将反转录cDNA稀释10个梯度（109-100copies/μL）作为模板，分别进行常规PCR和qPCR反应，比较此两种方法的灵敏度[104]。2.8.6qPCR的重复性试验用稀释的108-104copies/μL的DNA作为模板，每个浓度做3次重复，进行qPCR反应。将以上不同浓度模板进行连续3d（每天一次）试验，统计每个浓度梯度的反应CT值，并计算其平均值、标准差（SD）和变异系数（CV），从而考察不同实验组间差异性[100]。3结果与分析3.1MYVVqPCR检测体系的建立及优化3.1.1MYVV和MYVB接种本氏烟用MYVV和MYVB侵染性克隆农杆菌注射接种本氏烟，接种后4d左右可以从新叶观察到发病症状，随着时间的增长，发病症状逐渐加重，接种后30d，植株主要表现为：叶片严重下卷、皱缩和黄脉（图3.1.）。接种后30d，选取表现明显症状的本氏烟植株顶部叶片组织，于-80℃保存备用。同时取健康对照本氏烟植株相同部位叶片组织进行保存，用作后续试验对照。21 西南大学硕士学位论文图3.1接种MYVV和MYVB的本氏烟Fig.3.1N.benthamianaco-inoculatedwithMYVVandMYVB3.1.2PCR扩增与克隆鉴定以提取的发病植株DNA为模板，用引物Y47-qpcr-F/R对MYVV进行PCR扩增，扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳，结果显示阳性对照都有特异条带，基因片段大小231bp，且无引物二聚体和非特异扩增（图3.2）。将扩增产物经切胶纯化回收，克隆后送华大基因公司测序，序列在NCBI经Blast分析，与MYVV序列（登录号：NC_004634）同源性最高为100％，进一步明确了扩增片段的正确性。M12345678500bp250bp231bp100bp图3.2PCR扩增MYVV片段M：Marker；1-6：阳性对照；7：阴性对照；8：空白对照Fig.3.2PCRamplificationofMYVVfragmentM:Marker1-6:Positivecontrol;7:Negativecontrol;8:Blankcontrol3.1.3退火温度的确定以1.5×106copies/μL的DNA为模板，设置退火温度从53-63℃（图3.3-B）进行实时荧光定量梯度PCR反应。结果显示，通过比较荧光强度和CT值大小及特异性确定最佳退火温度。当退火温度为61.3℃时，荧光值最高，CT值最小，为20.0222 第三章两种双生病毒及其伴随β卫星实时荧光定量PCR体系的建立与优化（图3.3），表明该组下的扩增效率及检测灵敏度较其它组高。当退火温度为61℃时的熔解曲线仅见单一峰（图3.4），特异性好，故确定该体系退火温度61℃。图3.3梯度qPCRA:各温度下的扩增曲线；1-8分别为63.0、53.0、59.4、53.7、56.9、55.0、62.5、61.3℃；B：退火温度从53.0℃到63.0℃；C：阈值循环数Fig.3.3ThegradientqPCRA:Theamplificationcurve;1-8indicatethetemperatureof63.0、53.0、59.4、53.7、56.9、55.0、62.5、61.3℃,respectively;B:Annealingtemperaturesfrom53.0to63.0℃;C:Thethresholdcycles图3.4退火温度为61℃时的熔解曲线Fig.3.4Themeltingcurveat61℃ofannealingtemperatures3.1.4引物浓度的优化以标准DNA样品为模板，用不同稀释浓度的引物进行qPCR，观察各引物浓度下的扩增效率。比较结果发现，引物浓度为600nmol/μL时扩增效率最高，达到103.4%，相关性系数为0.998（图3.5），故确定600nmol/μL为该体系引物最佳浓度。23 西南大学硕士学位论文CorelationCoefficent:0.998Slope:-3.246Intercept:39.978RCREfficiency:103.4%循环阈值Thresholdcycle初始模板量对数Logstartingquantitycopynumber图3.5引物浓度为600nmol/μL时的标准曲线Fig.3.5Thestandardcurveat600nmol/μLofprimerconcentration3.1.5标准曲线的建立通过退火温度和引物浓度的优化，确定了MVYYqPCR反应的最佳体系（20μL）为：2×MasterMix10μL、Y47-qpcr-F/R(10umol/L)各1.2μL；DNA模板（106copies/μL）1μL，最后用ddH2O补足20μL。扩增程序为：95℃30min，(95℃10s，61℃30s，72℃30s)×40个循环。扩增后采集熔解曲线程序，样品加热到95℃，马上降至65℃并保持5s，然后按照1.75℃·s-1递增到95℃，在升温时收集荧光信号，建立熔解曲线，每个样品3个技术重复，同时设负对照。通过图3.6和图3.7可以看出，标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，相关性系数为0.998，扩增效率达104.7%。图3.6不同浓度DNA的qPCR扩增曲线1-7：1.5×108~1.5×102copies/μL；8：阴性对照Fig.3.6AmplificationcurveofqPCRatdifferentconcentrationsofdilutedDNA1-7：1.5×108~1.5×102copies/μL；8：Negativecontrol24 第三章两种双生病毒及其伴随β卫星实时荧光定量PCR体系的建立与优化图3.7qPCR的标准曲线Fig.3.7standardcurveofqPCR3.1.6MYVVqPCR体系的方法学测试3.1.6.1特异性测试结果通过对6种常见双生病毒样品MYVV、TYLCCNV、PaLCuCNV、TbLCYNV、AYVV和TbCSV在相同体系和条件下进行扩增。结果显示，除MYVV外，其他样品均无荧光信号增加（图3.8），表明引物特异性较好，可以对MYVV进行特异性扩增，准确定量结果。图3.8qPCR的特异性检测Fig.3.8SpecificitytestofqPCR3.1.6.2灵敏性试验qPCR和常规PCR灵敏性测试结果表明，qPCR能够检测到最低DNA浓度为1.5×10copies/μL，而常规PCR只能检测到最低DNA浓度为1.5×103copies/μL（图3.9和图3.10），表明qPCR的检测灵敏度比常规PCR的高100倍。25 西南大学硕士学位论文M123456789101112图3.9PCR扩增MYVVM：Marker；1-10：1.5×109~1.5×100copies/μL；11：阴性对照；12：空白对照Fig.3.9AmplificationofMYVVbyPCRM：Marker；1-10:1.5×109~1.5×100copies/μL；11:NegativeControl;12:Blankcontrol图3.10不同浓度DNA的qPCR扩增曲线1-9：1.5×109~1.5×101copies/μL；10：1.5×100copies/μLFig.3.10AmplificationcurveofqPCRatdifferentconcentrationsofdilutedDNA1-9：1.5×109~1.5×101copies/μL；10：1.5×100copies/μL3.1.6.3重复性试验qPCR重复性检测结果显示，组内重复和组间重复的最大变异系数分别为0.70%和0.87%（表3.2），表明该方法具有较好的组内和组间重复性。26 第三章两种双生病毒及其伴随β卫星实时荧光定量PCR体系的建立与优化表3.2重复性试验结果Tab.3.2Theresultofreproducibilitytest组内重复组间重复Reproducibillitytestofintra-assayReproducibillitytestofextra-assayDNACt平均值copies/μL标准差变异系数（%）Ct平均值标准差变异系数（%）MeanCtSDCV（%）MeanCtvalueSDCV（%）value1.5×10813.210.020.1513.190.070.561.5×10716.490.110.7016.530.140.871.5×10620.050.020.1120.030.080.421.5×10523.250.080.3423.350.090.381.5×10426.620.140.5126.770.090.343.2MYVBqPCR检测体系的建立及优化同3.1，以提取的发病植株DNA为模板，用引物Y47β-Q-F/R对MYVB进行PCR扩增，经克隆测序、Blast分析后，确定扩增片段的正确性。然后以9.5×105copies/μL的DNA样品为模板，设置退火温度梯度从52-62℃（图3.11-B）进行实时荧光定量梯度PCR，通过比较荧光强度（图3.11-A）和CT值大小（图3.11-C）及特异性，确定最佳退火温度为58℃，且溶解曲线仅见单一峰（图3.12）。以标准品DNA为模板，用不同引物浓度进行qPCR，观察各引物浓度下的扩增效率。结果比较发现，引物浓度为500nmol/μL时扩增效率最高，达到100.7%，相关性系数为1.000（如图3.13）。因此确定500nmol/μL为该体系最佳引物终浓度。图3.11梯度qPCRA:各温度下的扩增曲线，1-8分别为62.0、61.4、60.3、58.4、55.9、54.0、52.7、52℃；B：退火温度从52.0℃到62.0℃；C：阈值循环数Fig.3.11ThegradientqPCRA:Theamplificationcurve,1-8indicatethetemperatureof62.0、61.4、60.3、58.4、55.9、54.0、52.7、52℃,respectively;B:Annealingtemperaturesfrom52.0to62.0℃;C:Thethresholdcycles27 西南大学硕士学位论文图3.12退火温为58℃时的熔解曲线Fig.3.12Themeltingcurveatannealingtemperaturesof58℃图3.13引物浓度为500nmol/μL时的标准曲线Fig.3.13Thestandardcurveatprimerconcentrationof500nmol/μL通过对退火温度和引物浓度的优化，最终确定了MYVBqPCR的反应体系（20μL）：2×MasterMix10μL、Y47β-Q-F/R(10umol/L)各1.0μL；DNA模板1μL、ddH2O补足20μL；扩增程序为：95℃30min，(95℃10s，58℃30s，72℃30s)×40个循环。扩增后采集熔解曲线程序，样品加热到95℃，马上降至65℃并保持5s，然后按照1.75℃·s-1递增到95℃，在升温时收集荧光信号，建立熔解曲线，每个样品3个技术重复，同时设负对照和空白对照。通过图3.14可以看出，标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，相关性系数为1.000，扩增效率达101.2%。28 第三章两种双生病毒及其伴随β卫星实时荧光定量PCR体系的建立与优化图3.14qPCR标准曲线Fig.3.14ThestandardcurveofqPCR3.3TbCSVqPCR检测体系的建立及优化接种TbCSV和TbCSB侵染性克隆后，本氏烟的典型症状为：接种后5d左右可以观察到症状从新叶开始，随着接种时间的增长，发病症状逐渐加重；主要表现为：叶片严重下卷、皱缩和曲茎（图3.15）。接种后30d，选取发病本氏烟植株顶部叶片呈严重下卷、皱缩症状的叶片组织于-80℃保存，同时采集健康对照相同部位叶片组织保存用于对照试验。图3.15接种TbCSV和TbCSB30d后本氏烟症状Fig.3.15ThesymptomsofN.benthamianaco-inoculatedwithTbCSVandTbCSBat30dayspostinoculation同3.1，以提取的发病植株叶片DNA为模板，用引物Y35-qpcr-F/R对TbCSV进行PCR扩增，经克隆侧序和Blast分析后，确定扩增片段的正确性。以1.0×106copies/μL的DNA为模板，设置退火温度梯度从53-63℃（图3.16-B）进行qPCR，通过比较荧光强度（图3.16-A）和CT值大小（图3.16-C）及特异性，确定最佳退火温度为61℃，且溶解曲线仅见单一峰（图3.17）。以标准品DNA为模板，用不同浓29 西南大学硕士学位论文度的引物进行qPCR，观察各浓度引物的扩增效率。结果比较发现，引物浓度为400nmol/μL时扩增效率最高，达到100.2%，相关性系数为1.000（如图3.18），因此确定400nmol/μL为该体系的最佳引物终浓度。图3.16梯度qPCRA:各温度下的扩增曲线，1-8分别为63.0、62.5、61.3、59.4、56.9、55.0、53.7、53℃；B：退火温度53.0t-63.0℃；C：阈值循环数Fig.3.16Gradientreal-timePCRA:Theamplificationcurve,1-8indicatethetemperatureof63.0、62.5、61.3、59.4、56.9、55.0、53.7、53℃,respectively;B:Annealingtemperaturesfrom53.0to63.0℃;C:Thethresholdcycles图3.17退火温度为61℃时的熔解曲线Fig.3.17Themeltingcurveatannealingtemperatureof61℃30 第三章两种双生病毒及其伴随β卫星实时荧光定量PCR体系的建立与优化图3.18引物浓度为400nmol/μL时的标准曲线Fig.3.18Thestandardcurveatprimerconcentrationof400nmol/μL通过退火温度和引物浓度的优化，确定了TbCSVqPCR反应的最佳体系（20μL）：2×MasterMix10μL、Y35-qpcr-F/R(10umol/L)各1.0μL；DNA模板0.8μL、ddH2O补足20μL；扩增程序为：95℃30min，(95℃10s，61℃30s，72℃30s)×40个循环。扩增后采集熔解曲线程序，样品加热到95℃，马上降至65℃并保持5s，然后按照1.75℃·s-1递增到95℃，在升温时收集荧光信号，建立熔解曲线，每个样品3个技术重复，同时设负对照和空白对照。通过图3.19可以看出，标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，相关性系数为1.000，扩增效率达100.8%。图3.19qPCR标准曲线Fig.3.19ThestandardcurveofqPCR3.4TbCSBqPCR检测体系的建立及优化同3.1，以提取的发病植株DNA为模板，用引物Y35β-Q-F/R对TbCSB进行PCR扩增，经克隆侧序和Blast分析后，确定扩增片段的正确性。以浓度8.0×105copies/μL31 西南大学硕士学位论文的DNA为模板，退火温度从53-63℃（图3.20-B）进行实时荧光定量梯度PCR，通过比较荧光强度（图3.20-A）和CT值大小（图3.20-C）及特异性，确定最佳退火温度为60℃，且溶解曲线仅见单一峰（图3.21）。以标准品DNA为模板，用不同浓度的引物进行qPCR，观察各浓度引物的扩增效率。比较发现，引物浓度为500nmol/μL时扩增效率最高，达到102.2%，相关性系数为1.000（如图3.22），因此确定500nmol/μL为该体系的最佳引物终浓度。图3.20梯度qPCRA:各温度下的扩增曲线，1-8分别为63.0、62.5、61.3、59.4、56.9、55.0、53.7、53℃；B：退火温度52.0-62.0℃；C：阈值循环数Fig.3.20ThegradientqPCRA:Theamplificationcurve,1-8indicatethetemperatureof62.0、61.4、60.3、55.8、58.4、54.0、52.7、52℃,respectively;B:Annealingtemperaturesfrom52.0to62.0℃;C:Thethresholdcycle图3.21退火温为60℃时的熔解曲线Fig.3.21Themeltingcurveatannealingtemperatureof60℃32 第三章两种双生病毒及其伴随β卫星实时荧光定量PCR体系的建立与优化图3.22引物浓度为500nmol/μL时的标准曲线Fig.3.22Thestandardcurveatprimerconcentrationof500nmol/μL通过退火温度和引物浓度的优化，确定了TbCSBqPCR的最佳反应体系（20μL）：2×MasterMix10μL、Y35β-Q-F/R(10umol/L)各1.0μL；DNA模板0.8μL、ddH2O补足20μL；扩增程序为：95℃30min，(95℃10s，60℃30s，72℃30s)×40个循环。扩增后采集熔解曲线程序，样品加热到95℃，马上降至65℃并保持5s，然后按照1.75℃·s-1递增到95℃，在升温时收集荧光信号，建立熔解曲线，每个样品3个技术重复，同时设负对照和空白对照。通过图3.23可以看出，标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，相关性系数为1.000，扩增效率达100.7%。图3.23qPCR标准曲线Fig.3.23ThestandardcurveofqPCR4.讨论由于MYVV和TbCSV的寄主种类多，可侵染烟草、番茄、南瓜、木薯、棉33 西南大学硕士学位论文花、赛葵[105]、锦葵和胜红蓟[106]等作物和杂草，且发生范围广泛，如四川、云南、广西、广东及福建等地区。因此建立一个快速、灵敏、准确的检测技术对这两种病毒的发生分布、为害状况调查及提早防治，从而减轻这两种病毒病害所造成的损失，具有十分重要的意义。目前MYVV、TbCSV的检测方法主要有血清学、分子杂交和PCR检测技术等，这些方法在检测速度、灵敏度及特异性有一定的优越性。但是，血清学方法检测的缺点是容易出现假阳性的结果，而普通PCR技术不能检测到微量病毒且不能确定病毒具体含量，这两种检测技术均不能精确反映实验室条件和自然条件下病毒在寄主中的复制动态[107]。实时荧光定量PCR技术通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术与血清学和普通PCR法相比，具有操作简便、快速、特异、灵敏等优点，并且是边扩增边检测，可以直接通过仪器软件生成的熔解曲线来判断结果，无需通过电泳进行结果分析，大大节省了检测时间和工作量，并且可以对样品中病毒拷贝数进行准确定量。目前实时荧光定量PCR技术已广泛用于病毒检测[108]。本研究基于MYVV、TbCSV及其β卫星的全基因组，在其相对保守的区域分别设计了4对分别用于特异性检测的实时荧光定量PCR引物。引物的质量是决定实时荧光定量PCR反应的最重要因素，常常关系到整个实验的成败。除了引物设计过程中要避免引物的非特异性扩增、引物二聚体、发夹结构及错配[109]，还要在反应过程中优化引物浓度及反应体系，避免产生非特异性扩增及优化得到最佳的扩增效率。引物浓度太高，或引物质量不高，则易引起引物二聚体的产生；引物浓度太低，则可能导致扩增效率下降，最终仪器所记录的荧光信号不能真实地反映基因表达水平。所以应在确保扩增效率，尽量避免引物二聚体产生的前提下，以最小CT值、最高荧光值和无非特异扩增作为标准，分别对退火温度和引物浓度等参数进行优化，同时，对一系列的反应条件参数也进行优化，最终获得最佳检测体系[103]。本实验建立的实时荧光定量PCR检测体系最低可检测到DNA浓度10copies/μL，而且所选择标准品的9个浓度梯度的溶解曲线均显示为单一峰，且峰形一致、锐利，无明显的引物二聚体或者非特异性扩增峰出现，表明该方法的实验结果可靠，可以进行实际应用。此外，该方法比普通PCR灵敏度高100倍，可以精确检测寄主中两种病毒各组分的含量。将标准品DNA稀释7个浓度梯度34 第三章两种双生病毒及其伴随β卫星实时荧光定量PCR体系的建立与优化（108-102copies/μL）分别作为模板进行检测，扩增效率（90-110%）在实时荧光定量PCR效率范围内，标准曲线的相关系数在0.998-1.000之间，表明标准品浓度与循环数之间具有良好的相关性。当标准品DNA浓度在109-10copies/μL时，用该实时荧光定量PCR反应能准确检测出未知样品的拷贝数，进一步表明所得结果真实可信。通过熔解曲线、标准曲线的扩增效率及方法学验证结果表明本研究建立的SYBRGreenI实时荧光定量PCR方法灵敏、快速、有效，可以准确定量检测出植株中MYVV、TbCSV及其β卫星的含量，可用作研究这两种病毒及其β卫星在寄主中的动态复制过程，为病毒之间的互作机制研究奠定了基础。另外，该方法可用于对田间样品的检测，可以在较短时间内检测大量的样品，从而获得更多的有效数据，在植病流行学中病毒初始量的定量分析、寄主抗性基因快速鉴定以及病毒病害流行的动态监测等方面具有重要意义。35 西南大学硕士学位论文36 第四章MYVV与同源卫星MYVB或异源卫星TbCSB之间的互作研究第四章MYVV与同源卫星MYVB或异源卫星TbCSB之间的互作研究MYVV分离物Y47（Y47A）是从云南烟草上分离的一种单组份双生病毒，伴随有β卫星分子(Y47β)[52]。单独接种MYVV30d后不表现症状，而当与其同源β卫星共同接种时，4d后开始出现典型的黄脉、叶片下卷、脉突等症状，且寄主体内病毒DNA积累水平较单独接种MYVV时高，表明Y47β是Y47A诱导典型症状所必须的。青玲[55]研究表明，与MYVV属同一致病类型的TYLCCNV，伴随同源β卫星（TYLCCNB）或异源β卫星（TbCSB）时引起的症状均不同，表明症状差异是由β卫星引起的，进一步证明了β卫星与症状调节有关。为了明确MYVV与不同β卫星互作是否也存在这种现象，本章对MYVV与同源β卫星分子(MYVB)及异源β卫星分子（TbCSB）之间的互作进行了研究，并运用已建立的qPCR技术监测寄主植株中病毒及β卫星的含量变化。1实验材料1.1植物材料本氏烟(N.benthamiana)由西南大学植物保护学院植物病毒实验室提供。1.2病毒侵染性克隆TbCSVY35A和卫星Y35β的侵染性克隆、MYVVY47A和卫星Y47β的侵染性克隆由浙江大学生物技术研究所周雪平教授惠赠。1.3菌株、酶和克隆载体等大肠杆菌E.coliDH5α，购自北京全式金生物技术有限公司；TaqDNA聚合酶、PrimerSTARDNA聚合酶购自Takara公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自TIANGEN公司；克隆载体PGEM-TEasyvector，购自Promega公司。1.4常用实验仪器本实验所用的PCR仪购自Bio-Rad，分光光度计、冷冻离心机和常温离心机均为Eppendorf公司产品，凝胶成像仪购自GeneCompanyLimited公司；电泳仪购自北京六一公司。2实验方法2.1农杆菌介导的本氏烟接种37 西南大学硕士学位论文方法参照第三章2.12.2植物总DNA的提取采用常规CTAB法提取本氏烟基因组总DNA，方法参照第三章2.22.3普通PCR技术以提取的植物总DNA为模板，分别根据GenBank中Y35A及Y35β的保守区序列、Y47A及Y47β的保守取序列，利用DNAMAN软件分别设计了4对特异性检测引物TbCSV(Y1F1/Y6R2)[55]、TbCSB(Y1β1/β02)、MYVV(Y47F/R)、MYVB(MYVV-β01/MYVV-β02)（表4.1），用NCBIPrimer-BLAST进行检索，保证引物的特异性。4种组份PCR检测反应的体系及扩增条件如下：(1)取一无菌PCR管（0.2mL），依次加入下列试剂后，加双蒸水(ddH2O)至总体积为25μL。反应试剂体积10×反应缓冲液2.5μLdNTPs，10mM0.5μLMgCl2，25mM1.5μL上游引物，20M0.5μL下游引物，20M0.5μL模板DNA0.5μLTaqDNA聚合酶，5U/μL0.2μL(2)反应条件参数设置：①94℃预变性2min后，开始以下循环：②94℃预变性45sX℃退火45s（X值视引物的Tm值而定）72℃延伸Ys(Y值视目的片段大小而定)③重复步骤②，30～35个循环；④72℃延伸10min;(3)反应结束，取5μL扩增产物电泳检测扩增结果表4.1PCR扩增所用引物序列Tab.4.1SequencesofprimersusedforPCRamplification引物引物序列（5’-3’）PrimersSequence(5’-3’)Y47-q-FGGGATCCACTTGTAAACGAGY47-q-RGCTGTCGAAGTTCAGACGA38 第四章MYVV与同源卫星MYVB或异源卫星TbCSB之间的互作研究Y47β-q-FACTGAAAAGGAAAGAAAACGY47β-q-RCGGGGGTATTTTTGGAAAGTY35-q-FGTCACCAAAGCAAGAGCAY35-q-RACCCAAGACATAAACGGAY35β-q-FTGGTCTCTTGTTGGGCTCTTY35β-q-RAGAAGCGGCTGTTGAGGATANbActin/FAGGCTGTTCTTTCCCTCTATGCNbActin/RCAACTTCTCCTTCACATCCCTAACY47-FTTCTATTTTGCGTTCCAGGAY47-RAAGTACAGCACAGGGAAGCGY1F1CGTAGGCCTGTGGATAAACCTCAAGATY6R2GGAAGCCAGTTCAAATTAAAGGY1β1GCCAAAAAGGATTACTGGGTATβ02GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACACMYVV-β01GTAAGGCTTATTATCTTGATGMYVV-β02CTATAACCAACAACAACATAAACGGGCC2.4qPCR检测病毒积累量利用第三章设计的qPCR引物和建立的体系检测病毒积累量(见表4.1)，选用内参基因NbActin(表4.1)。（1）MYVV检测以接种本氏烟总DNA为模板，利用Y47-qpcr-F/R对MYVV进行扩增，NbActin为内参基因。反应体系及反应参数如下：取qPCR专用八连管，依次加入以下试剂，ddH2O补足20μLTaqqPCRMasterMix，10mmol/L10.0μLY47-q-F，20umol/L1.2μLY47-q-R，20umol/L1.2μL标准DNA1.0μL反应参数预变性94℃3min变性95℃10s退火61℃30s延伸72℃30s40个循环结束后，样品加热到95℃，立即降至65℃并保持5s，然后按照1.75℃·s-1递增到95℃，在升温时收集荧光信号，建立熔解曲线。（2）MYVB检测以发病本氏烟总DNA为模板，利用Y47β-Q-F/R对MYVB进行扩增，NbActin为内参基因。反应体系及反应参数如下：39 西南大学硕士学位论文取qPCR专用八连管，依次加入以下试剂，ddH2O补足20μLTaqqPCRMasterMix，10mmol/L10.0μLY47β-q-F，20umol/L1.0μLY47β-q-R，20μmol/L1.0μL标准DNA1.0μL反应参数预变性94℃3min变性95℃10s退火58℃30s延伸72℃30s40个循环结束后，样品加热到95℃，马上降至65℃并保持5s，然后按照1.75℃·s-1递增到95℃，在升温时收集荧光信号，建立熔解曲线。（3）TbCSV检测以发病本氏烟总DNA为模板，利用Y35-qpcr-F/R对TbCSV进行扩增，NbActin为内参基因。反应体系及反应参数如下：取qPCR专用八连管，依次加入以下试剂，ddH2O补足20μLTaqqPCRMasterMix，10mmol/L10.0μLY35-q-F，20umol/L0.8μLY35-q-R，20umol/L0.8μL标准DNA1.0μL反应参数预变性94℃3min变性95℃10s退火61℃30s延伸72℃30s40个循环结束后，样品加热到95℃，马上降至65℃并保持5s，然后按照1.75℃·s-1递增到95℃，在升温时收集荧光信号，建立熔解曲线。（4）TbCSB检测以发病本氏烟总DNA为模板，利用Y35β-Q-F/R对TbCSB进行扩增，NbActin为内参基因。反应体系及反应参数如下：取qPCR专用八连管，依次加入以下试剂，ddH2O补足20μLTaqqPCRMasterMix，10mmol/L10.0μLY35β-q-F，20umol/L1.0μLY35β-q-R，20umol/L1.0μL标准DNA1.0μL反应参数预变性94℃3min变性95℃10s退火60℃30s延伸72℃30s40个循环结束后，样品加热到95℃，马上降至65℃并保持5s，然后按照40 第四章MYVV与同源卫星MYVB或异源卫星TbCSB之间的互作研究1.75℃·s-1递增到95℃，在升温时收集荧光信号，建立熔解曲线。反应程序结束后，进行数据分析：利用自带软件Bio-RadCFXManager确定qPCR的扩增曲线和熔解曲线。数据分析采用比较CT法。每个处理设置三个生物学重复以及三个反应重复。2.5PCR产物纯化参照第三章2.42.6分子克隆参照第三章2.52.7序列的测定与分析序列测定委托北京六合华大基因科技有限公司进行，通过BLAST(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)程序进行同源检索比对分析。3结果与分析3.1Y47A伴随Y47β或Y35β的侵染性及症状比较为了确定Y47A是否与Y35β卫星互作，将Y47A分别伴随同源卫星Y47β（Y47A+Y47β）及异源卫星Y35β（Y47A+Y35β）接种本氏烟，对两种复合体的侵染性及其诱导症状进行比较分析。结果发现，Y35β卫星可与Y47A互作，但是与Y47A+Y47β的侵染性存在差异，并且引起的症状也明显不同。在三个独立试验中，Y47A+Y47β在本氏烟上的侵染率为100%，而Y47A+Y35β在本氏烟上侵染性则较低，侵染率为72.7%，Y47A在本氏烟上的侵染率只为54.4%（表4.2）。通过比较接种后本氏烟表现症状的时间，结果显示，接种Y47A+Y47β第4d本氏烟即开始表现病毒症状，至第7d病毒症状已十分明显。而接种Y47A+Y35β后第7d本氏烟才开始出现病毒症状，第10d症状才表现明显（表4.2）。41 西南大学硕士学位论文表4.2MYVV-Y47伴随同源或异源β卫星分子的侵染性及诱导的症状Tab.4.2InfectivityandsymptomsinducedbyMYVV-Y47Aassociatedwithcognateorheterogeneousbetasatellitemolecules侵染性出现症状/严重症状Infectivity（接种后天数）组合症状Symptomappearance–severeInoculum试验Ⅰ试验Ⅱ试验ⅢSymptomssymptomexpressionExperimentExperimentExperiment(dayspostinoculation)ⅠⅡⅢaDLC,VT,VY,cY47A+Y47β8/810/1015/15b4-7CS,LCrULC,MildY47A+Y35β6/87/1011/157-10DLC,CS,STY47A4/86/108/15﹣﹣注：a发病植株/接种的植物；bDLC:向下叶卷;LCr:皱缩;VD:脉深绿;VY:黄脉;VT:脉增厚;CS:曲茎;ST:矮化；c平均来自三个独立试验Note:aSymptomaticplants/inoculatedplants;bDLC:downwardleafcurling;ULC:upwardleafcurling;LCr:leafcrumpling;VD:veindarkening;VY:veinyellowing;VT:veinthickening;CS:curlyshoot;ST:stunting;caveragefromthreeindependenttrials.Y47A单独接种时，可以侵染本氏烟和系统扩散，但不能诱导典型症状，随着时间的增长，也未见其诱导产生典型症状（图4.1，表4.2）。图4.1Y47A接种本氏烟诱导的症状Fig.4.1SymptomsinducedinN．benthamianainoculatedwithY47AY47A+Y47β接种本氏烟表现的典型症状为：在接种4d观察到发病症状从新叶开始，随着时间的增长，叶片出现严重向下卷曲、皱缩、黄脉、脉增厚等现象。而Y47A+Y35β接种本氏烟后表现的症状则明显不同，在接种7d才可观察到发病42 第四章MYVV与同源卫星MYVB或异源卫星TbCSB之间的互作研究症状从新叶开始，表现为新叶轻微下卷，随着时间的增长，老叶则表现为叶轻微上卷，并且茎严重扭曲、矮化，没有观察到黄脉和叶皱缩现象（表4.2，图4.2）图4.2Y47A伴随同源或异源β卫星接种本氏烟诱导的症状Fig.4.2SymptomsinducedinN．benthamianainoculatedwithY47Aassociatedwithcognateorheterogeneousbetasatellitemolecules通过比较Y47A伴随Y47β或Y35β卫星接种本氏烟90d的症状（健康植株为对照），结果显示，Y47A+Y35β接种本氏烟所引起的叶卷程度不及Y47A+Y47β所引起的，但其矮化、曲茎症状明显。Y47A+Y47β表现的皱缩、黄脉和脉突症状明显，其矮化、茎扭曲症状不明显（图4.3）。图4.3Y47A伴随Y47β或Y35β接种90d本氏烟症状Fig.4.3SymptomsinducedinN．benthamianainoculatedwithY47Aassociatedwithcognateorheterogeneousbetasatellitemoleculesat90days43 西南大学硕士学位论文3.2Y47A伴随Y47β或Y35β接种本氏烟后Y47A的相对积累量为了确定Y47A伴随Y47β或Y35β接种本氏烟后，Y47A在本氏烟中不同时期的复制水平，利用设计的qPCR引物对两个接种组合接种本氏烟后30d、60d和90dY47A的相对积累量进行分析。结果显示，Y47A+Y47β接种本氏烟后，随着时间的增加，Y47A的积累量处于平缓下降趋势，与接种后30d相比，接种后90dY47A的积累量下降了近40%（图4.4-A）。而Y47A+Y35β接种本氏烟后，与接种后30d相比，接种后60d，Y47A的积累量急剧下降，下降了近80%，随后处于平稳状态（图4.4-B）。单独接种Y47A于本氏烟，对Y47A的积累量进行追踪检测，在第90d仍然可以检测到Y47A，但Y47A的积累量也呈现下降趋势，通过定量分析比较，与接种后30d的积累量相比，接种后90d下降了近75%（图4.4-C）。为了明确Y47A伴随Y35β接种本氏烟后，与伴随Y47β和单独接种后，本氏烟上Y47A积累量的变化，将Y47A+Y47β、Y47A+Y35β、Y47A分别接种本氏烟植株，在60d后对Y47A的复制水平进行分析。结果显示，接种后60d，接种Y47A+Y47β和Y47A+Y35β的本氏烟中Y47A的积累量均高于单独接种Y47A的积累量，且Y47A+Y47β中Y47A的积累量是单独接种Y47A的3倍，是接种Y47A+Y35β的近1.6倍（图4.4-D）。图4.4qPCR分析接种本氏烟中Y47A的相对积累量Fig.4.4TherelativeaccumulationlevelsofY47AinN．benthamianainoculatedwithY47Apluscognateorheterogeneousbetasatellitemolecule注(A)：接种Y47A+Y47β；（B）：接种Y47A+Y35β；(C)：接种Y47A；(D)：接种Y47A+Y47β、Y47A+Y35β、Y47A于本氏烟植44 第四章MYVV与同源卫星MYVB或异源卫星TbCSB之间的互作研究株第60dY47A的相对积累量。NbActin作为内参基因，每个平均值来自于三次独立的实验，每次独立实验包括三个重复，误差线表示标准偏差。Note(A)：InoculumofY47A+Y47β;（B）：InoculumofY47A+Y35β;(C)：InoculumofY47A;(D)：InoculumofY47A+Y47β、Y47A+Y35βandY47Arespectivelyat60dpi.TherelativeaccumulationlevelsofY47AwereanalyzedbyqPCR.Eachmeanvaluewasderivedfromthreeindependentexperiments(n=9)andeachindependentexperimentconsistedofthreereplicatesandnormalizedtoNbActinthatservedasaninternalstandard.Theerrorlineindicatesthestandarddeviation.3.3Y47A伴随Y47β或Y35β接种本氏烟后β卫星的相对积累量为了确定Y47A伴随Y47β或Y35β接种本氏烟后β卫星在各时期的积累量。利用Y47β、Y35β的qPCR引物对接种后各时期本氏烟中Y47β和Y35β积累量进行相对定量分析。Y47A+Y47β接种本氏烟后，第120d可以检测到Y47β。通过qPCR分析，随着时间的增加，Y47β的积累量处于下降趋势，相比于接种后30d，接种后90dY47β的积累量下降了近50%，在接种后120dY47β的积累量下降了近60%（图4.5-A）。为了确定Y47A是否支持Y35β稳定复制，用特异性引物Y1β1/β02对接种Y47A+Y35β的本氏烟中Y35β组分进行PCR检测。结果显示，Y35β可以依赖Y47A进行复制，甚至在180d的感病植株中依然可以扩增到Y35β组分的特异性条带。利用Y35βqPCR引物分别检测接种Y47A+Y35β后30d、60d、90d、120d本氏烟中Y35β的积累量。结果显示，与接种后30d相比，Y35β的积累量在接种后60d下降了近40%。但在第90dY35β的积累量却有所上升，与第60d的相比上升了13%。而在第120d又呈现下降趋势，相比于第30d，Y35β的积累量下降了近70%（图4.5-B）。为了确定伴随Y47A的同源卫星Y47β与异源卫星Y35β积累量的变化，将Y47A+Y47β、Y47A+Y35β分别接种本氏烟，在接种后30d和120d分析Y47β和Y35β的复制水平。结果显示，接种后30d，Y47A+Y47β中Y47β的积累量明显高于Y47A+Y35β中Y35β的积累量，高近40%。对比接种后120d两个卫星分子的积累量，Y47A+Y47β中Y47β的积累量和Y47A+Y35β中Y35β的积累量均较第30d下降，并且异源卫星Y35β的积累量依然低于同源卫星Y47β的积累量，低近25%（图4.5-C）。45 西南大学硕士学位论文图4.4qPCR分析接种本氏烟中β卫星的相对积累量Fig.4.4TherelativeaccumulationlevelsofbetasatelliteinN．benthamianainoculatedwithY47pluscognateorheterogeneousbetasatellitemolecules注（A）：接种Y47A+Y47β；（B）：接种Y47A+Y35β；(C)：接种Y47A+Y47β和Y47A+Y35β于本氏烟植株。NbActin作为内参基因，每个平均值来自于三次独立的实验，每次独立实验包括三个重复，误差线表示标准偏差。Note(A)：InoculumofY47A+Y47，每（B）：InoculumofY47A+Y35β;(C)：InoculumofY47A+Y47β、Y47A+Y35βrespectivelyat60dpi.TherelativeaccumulationlevelsofbetasatellitewereanalyzedbyqPCR.Eachmeanvaluewasderivedfromthreeindependentexperiments(n=9)andeachindependentexperimentconsistedofthreereplicatesandnormalizedtoNbActinthatservedasaninternalstandard.Theerrorlineindicatesthestandarddeviation.4讨论通过调查发现，我国的双生病毒主要是单组份双生病毒，单组份双生病毒又可细分为3种类型。大多数双生病毒不伴随β卫星分子，比如在我国分布最广、危害最重的番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV)[35]，中国番木瓜曲叶病毒(PapayaleafcurlChinavirus,PaLCCNV)，云南烟草曲叶病毒(TobaccoleafcurlYunnanvirus,TbLCYNV)等。有些双生病毒伴随β卫星分子，并且病毒必须依赖β卫星才能诱导寄主产生典型症状，如TYLCCNV及其卫星引起的病害复合体(TYLCCNV/TYLCCNB)[13]和MYVV及其卫星引起的病害复合体(MYVV/MYVB)[14]。少数双生病毒伴随β卫星分子，但病毒自身能诱导典型症状的产生，β卫星可加重病毒病症状，如TbCSV及其伴随β卫星分子(TbCSB)[39]。已有报道无论TYLCCNV还是TbCSV伴随同源或异源β卫星时引起的症状均不同，并且β卫星可被异源辅助病毒稳定复制[110,111]，表明症状差异是由β卫星引起的，不同双生病毒与卫星分子之间的互作机制可能不同[55]。本章研究中，通过症状观察发现，本氏烟单独接种Y47A后并不表现症状，46 第四章MYVV与同源卫星MYVB或异源卫星TbCSB之间的互作研究Y47A+Y47β接种本氏烟的典型症状为严重的向下叶卷，皱缩，黄脉，脉增厚现象，而Y47A+Y35β接种本氏烟所表现的症状则明显不同，表现为新叶轻微叶下卷，老叶则轻微上卷，并且茎严重扭曲、矮化，没有观察到黄脉和叶皱缩现象。且本氏烟接种Y47A+Y47β的显症时间比接种Y47A+Y35β早3d。另外，在三个独立试验中，Y47A+Y47β在本氏烟上的侵染率要高于Y47A+Y35β的侵染率。进一步表明β卫星与双生病毒致病性紧密相关，对于必须依赖β卫星致病的病害复合体，其辅助病毒伴随同源或异源β卫星所引起的症状、侵染率、显症时间均不相同。原因可能是：β卫星互补链编码的βC1蛋白其大小、位置和氨基酸序列都相对保守，有研究表明β卫星对病害症状的调节作用与βC1蛋白有关[58,112]。序列分析显示，Y47β和Y35β之间仅具有56.8%的序列同源性，表明β卫星编码的βC1蛋白可能与两种β卫星诱导症状的差异有关。尽管TYLCCNV与MYVV属同一致病类型，但已报道[55]TYLCCNV伴随异源卫星Y35β侵染植株只引起温和的曲叶症状[55]，与之不同，Y47A伴随异源卫星Y35β在本氏烟上可引起严重的曲茎症状，这表明同致病类型的病毒与β卫星之间的互作方式及其作用机理可能有所不同。本研究中发现，各种接种组合中辅助病毒DNA的积累量受β卫星的影响。如Y47A+Y47β、Y47A+Y35β中Y47A的积累量均要高于Y47A单独接种，表明当β卫星存在时，辅助病毒Y47A的积累量显著提高。陶小荣的研究也曾表明，共同接种TYLCCNV和TYLCCNB的植株中，用TAS-ELISA若能够检测到辅助病毒组分，则同时能观察到寄主的发病症状，并且病毒的浓度从检测不到的水平骤然增加到非常高的水平，表明β卫星可以迅速增强病毒的积累水平[113]。这可能是因为β卫星编码的βC1蛋白是多功能蛋白，既是症状决定因子还具有PTGS和TGS沉默抑制子活性[58,114]。PTGS，即在基因转录后的水平上，通过对靶标RNA进行特异性降解而使基因失活，导致mRNA的积累量很低或者检测不到，发生在细胞质。而TGS发生在细胞核，主要是由于启动子失活导致基因转录无法正常进行。有研究报道，βC1通过与寄主因子CaM和SAHH的互作[58]，抑制了寄主的基因沉默系统，进而为病毒的复制和系统移动等提供了有利的寄主环境，因而β卫星存在时，辅助病毒的积累量得以显著提高。qPCR的结果表明，当Y47A伴随Y35β时，其复制水平明显低于伴随Y47β的复制水平，并且Y47A+Y35β在接种60d时，Y47A的积累量显著下降，表明当辅助病毒伴随同源β卫星时，其辅助病毒的复制水平更高。而当Y35β作为异源β卫星伴随Y47A接种本氏烟时，异源β卫星可以稳定复制，但其复制水平明显低47 西南大学硕士学位论文于同源卫星Y47β的复制水平，表明伴随同一辅助病毒时异源β卫星的复制水平明显低于同源β卫星的复制水平。原因可能是，β卫星需要依赖辅助病毒进行复制、包装和介体传播，但大多β卫星却表现出很大的杂合性，也曾有报道，MYVV也可以支持异源卫星TYLCCNB或者泰国番茄黄化曲叶病毒β卫星(TomatoyellowleafcurlThailandbetasatellite，TYLCTHB)的复制[14]。另外，Hanley-Bowdoin等的研究表明：双组份双生病毒DNA-A和DNA-B之间含有一个高度保守的共同区（CR区），CR区包含不同的重复序列(Iteron)，Iteron介导与Rep的专化性结合并起始病毒基因组的复制，但β卫星序列中并不能找到类似于DNA-ACR区的iteron以及除了茎环结构外的其它复制所需的顺式作用元件[33]。以上现象和机理表明，β卫星在其复制过程中与β卫星Rep不具有严格的专化性互作。已明确双生病毒β卫星复制专化性的位置是茎环结构5’端上游的LCR区段上的Rep蛋白结合位点RBM，并发现Rep蛋白结合与之同源的RBM的能力强于结合异源RBM的能力，表明β卫星与同源辅助病毒之间的互作特异性比β卫星与异源辅助病毒之间特异性更强[115]。48 第五章MYVV/MYVB和TbCSV/TbCSB之间的互作研究第五章MYVV/MYVB和TbCSV/TbCSB之间的互作研究近年来粉虱传双生病毒在全球范围内的危害日益猖獗，在我国周边国家也已造成严重危害，而我国南方几个省份相继报道双生病毒以来，其危害已呈逐年加重的趋势。我国发现的粉虱传双生病毒多数伴随β卫星分子，β卫星是双生病毒病害复合体的重要致病因子。植物病毒在自然条件下复合侵染现象很普遍，前期研究中发现，在烟草和杂草上赛葵黄脉病毒（MYVV）和烟草曲茎病毒（TbCSV）发生普遍且常常复合侵染[105,116]，而复合侵染的病毒之间相互作用常表现为拮抗或协生[110,117]，比如TYLCCNV和TbCSV在心叶烟中存在拮抗作用[110]，因而研究MYVV和TbCSV的相互作用对于病毒病的防控具有重要意义。本章以MYVV和TbCSV及伴随β卫星为材料，开展了两种病毒及伴随β卫星病害复合体之间的互作研究。1实验材料1.1植物材料本氏烟(N.benthamiana)由西南大学植物保护学院植物病毒实验室提供。1.2病毒侵染性克隆烟草曲茎病毒（TbCSV）Y35A及伴随卫星Y35β侵染性克隆、赛葵黄脉病毒（MYVV）Y47A及伴随卫星Y47β侵染性克隆由浙江大学生物技术研究所周雪平教授惠赠。1.3菌株、酶和克隆载体等大肠杆菌E.coliDH5α，购自北京全式金生物技术有限公司；TaqDNA聚合酶、PrimerSTARDNA聚合酶购自Takara公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自TIANGEN公司；克隆载体PGEM-TEasyvector，购自Promega公司；1.4常用实验仪器本实验所用的PCR仪购自Bio-Rad，分光光度计、冷冻离心机和常温离心机均为Eppendorf公司产品，凝胶成像仪购自GeneCompanyLimited公司；电泳仪购自北京六一公司。2实验方法2.1农杆菌介导的植株接种49 西南大学硕士学位论文参照第三章2.12.2植物总DNA的提取采用常规CTAB法提取植物基因组DNA，参照第三章2.22.3普通PCR技术参照第四章2.32.4qPCR检测病毒积累量参照第四章2.42.5PCR产物纯化参照第三章2.42.6分子克隆参照第三章2.52.7序列的测定与分析序列测定委托北京六合华大基因科技有限公司进行，通过BLAST(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)程序进行比对。3结果与分析3.1Y47A和Y35A同时伴随β卫星接种本氏烟的侵染性及症状为了明确Y47A/Y47β与Y35A/Y35β的互作情况，以及两种病毒及其伴随β卫星引起的症状及其复制水平的差异，将Y47A+Y35A+Y47β+Y35β同时接种本氏烟，并以Y47A+Y47β、Y47A+Y35β、Y35A+Y35β、Y35A+Y47β接种本氏烟作为对照，定期观察并记录症状。结果发现，接种30d后，接种Y47A+Y35A+Y47β+Y35β的本氏烟表现出的症状，与Y47A+Y47β、Y47A+Y35β、Y35A+Y35β、Y35A+Y47β诱导的症状均不相同。接种Y47A+Y35A+Y47β+Y35β的本氏烟表现出皱缩、向下卷叶、黄脉、曲茎、矮化、脉突等症状比Y47A+Y47β、Y47A+Y35β、Y35A+Y35β、Y35A+Y47β诱导的此类症状更为严重。但是在侵染后期，其诱导的症状则与Y35A+Y35β引起的症状相似，到侵染后150d，则在感病植株上，观察不到黄脉现象，而曲茎、皱缩、矮化等症状依然明显（图5.1）。50 第五章MYVV/MYVB和TbCSV/TbCSB之间的互作研究图5.1Y47A+Y47β+Y35A+Y35β同时接种本氏烟诱导的症状Fig.5.1SymptomsinducedinN.benthamianainoculatedwithY47A+Y47β+Y35A+Y35β在侵染的不同时期提取接种Y47A+Y35A+Y47β+Y35β的本氏烟的基因组总DNA，用引物Y47-F/R、Y1F1/Y6R2对接种植株中可能存在的Y47A、Y35A进行PCR扩增，用引物Y1β1/β02、MYVV-β01/MYVV-β02分别扩增接种植株中可能存在的Y47β、Y35β的特异性片段（表5.1）。检测结果表明，在整个病毒侵染过程中，从所有的感病本氏烟中均可以扩增到Y35A和Y35β的特异性条带，表明Y35A和Y35β在整个病毒侵染过程中可以一直稳定复制。但在接种后第90d，10株接种Y47A+Y35A+Y47β+Y35β的本氏烟中仅有5株可以检测到Y47A，到120d仅剩2株可检测到Y47A，到180d时则所有接种植株均检测不到Y47A的特异性条带；而Y47β的检测结果表明，在接种后第90d，10株接种本氏烟中仅有2株可以检测到Y47β，到120d则所有接种植株均检测不到Y47β的特异性条带，表明在Y47A/Y47β与Y35A/Y35β共同侵染本氏烟的后期，Y47A和Y47β分子均丢失。表5.1接种本氏烟中的两种病毒及其β卫星的特异性检测Tab.5.1Thespecificdetectionoftwohelpervirusesandtheirbetasatellitesinco-inoculatedN.benthamianaplants检测病毒或卫星组合时间DetectionofviralorbetasatelliteDNAInoculumDaysTbCSVMYVVTbCSBMYVBY47A+Y47β+Y35A+Y35β30a10/10b10/1010/1010/106010/109/1010/108/109010/105/1010/102/1012010/102/1010/100/1018010/100/1010/100/10注:a接种后的天数b检测呈阳性的植株数/接种的植株数（平均来自三个独立试验）note:aDaypostinoculationonwhichviralDNAdetectedbviralDNAdetectedplants/inoculatedplants(averagefromthreeindependenttrials)3.2接种本氏烟中各病毒及β卫星的积累量为了明确接种本氏烟中Y47A和Y35A及其β卫星在不同时期的复制水平，利用Y47A、Y35A、Y47β、Y35β的qPCR引物对接种后不同时期各组分的相对积累51 西南大学硕士学位论文量进行了分析。积累量分析结果显示，在Y47A+Y35A+Y47β+Y35β接种本氏烟30d、60d、90d和120d这4个时间点中，相比于接种后30d，Y47A的积累量在第60d有一定的上升，上升了约20%；但在第90dY47A的积累量急剧下降，比第60d下降了近3倍，到第120d则下降了近6倍（图5.2-A）。与表5.1的结果一致，随着时间的推移，Y47A的积累量逐渐降低，到第140dY47A丢失。在接种后30d和60d后，接种本氏烟中Y47β的积累量有一个平缓的下降趋势；但在第90dY47β的积累量呈急剧下降，与第30d检测时Y47β的积累量相比，第90dY47β的积累量下降了近7倍，而在第120d则检测不到Y47β的积累量（图5.2-B）。与表5.1的结果一致，在Y47A+Y35A+Y47β+Y35β侵染的后期Y47β丢失。在接种后第30d、60d、90d和120d，对接种Y47A+Y35A+Y47β+Y35β的本氏烟中Y35A和Y35β的积累量进行相对定量分析，结果显示，Y35A和Y35β的积累量在接种后30d和90d，均呈现上升趋势，在第90d达到最高值，Y35A在90d的积累量上升了近3倍相比于30d，Y35β上升了近2.5倍；但Y35A和Y35β的积累量均在第120d时下降，但二者的积累量依然高于其60d的积累量,与Y47A和Y47β的积累量呈现相反的趋势（图5.2-C）。图5.2接种本氏烟中各病毒及β卫星在不同时期的相对积累量分析Fig.5.2TherelativeaccumulationlevelsofhelpervirusesandbetasatellitesinN．benthamianainoculatedwithY47A+Y47β+Y35A+Y35β注：(A)Y47A；（B）47β；(C)Y35A；(D)Y35β。.NbActin作为内参基因，每个平均值来自于三次独立的实验，每次独立实验包括三个重复，误差线表示标准偏差。52 第五章MYVV/MYVB和TbCSV/TbCSB之间的互作研究Note(A)Y47A；（B）47β；(C)Y35A；(D)Y35β.Eachmeanvaluewasderivedfromthreeindependentexperiments(n=9)andeachindependentexperimentconsistedofthreereplicatesandnormalizedtoNbActinthatservedasaninternalstandard.Theerrorlineindicatesthestandarddeviation.为了明确不同接种组合中Y47A积累量的变化，分别将Y47A+Y47β+Y35A+Y35β、Y47A+Y47β、Y47A+Y35β、Y47A接种本氏烟植株，在接种后60d对Y47A的积累量进行qPCR分析。结果显示，接种Y47A+Y47β、Y47A+Y35β和Y47A+Y47β+Y35A+Y35β的本氏烟植株中，Y47A的积累量均高于单独接种Y47A的积累量，且接种Y47A+Y47β本氏烟中Y47A的积累量水平最高，高出单独接种Y47A的近3.8倍，分别是接种Y47A+Y35β和Y47A+Y47β+Y35A+Y35β的1.9倍和1.6倍。比较接种Y47A+Y35β和Y47A+Y47β+Y35A+Y35β后Y47A积累量，结果发现，后者比前者中Y47A的积累量高20%，表明Y47A伴随同源卫星Y47β时其积累量比伴随异源卫星Y35β时高（图5.3）。图5.3接种后60d本氏烟植株中Y47A的相对积累量分析Fig.5.3TherelativeaccumulationlevelsofY47AinN．benthamianainoculatedwithY47A+Y47β+Y35A+Y35β、Y47A+Y47β、Y47A+Y35β、Y47Aat60days注：NbActin作为内参基因，每个平均值来自于三次独立的实验，每次独立实验包括三个重复，误差线表示标准偏差。Note:Eachmeanvaluewasderivedfromthreeindependentexperiments(n=9)andeachindependentexperimentconsistedofthreereplicatesandnormalizedtoNbActinthatservedasaninternalstandard.Theerrorlineindicatesthestandarddeviation.4讨论在自然条件下，植物受多种病毒复合侵染的现象非常普遍。当不同的病毒或者病毒株系进行复合侵染时，其相互作用方式又随着复合侵染的病毒种类及寄主不同而表现各异，既有加重病害的协生作用，也存在有利于病毒防治的交叉保护作用[110,117]。随着病毒类型趋向复杂化，病毒之间、病毒与卫星之间及病毒与寄主之间的相互作用方式更加千变万化。在我国发现的粉虱传双生病毒多数伴随β卫星分子，β卫星是双生病毒病害复合体的重要致病因子。前期研究中发现，在烟草53 西南大学硕士学位论文和杂草上MYVV和TbCSV发生普遍且常常复合侵染，由于复合侵染中病毒之间存在复杂的相互作用，因而研究MYVV和TbCSV的相互作用对于病毒病的防控具有重要意义。本研究通过症状观察发现，接种Y47A+Y35A+Y47β+Y35β的本氏烟在侵染早期表现较严重的皱缩、向下卷叶、黄脉、曲茎、矮化、脉突等症状，与Y47A+Y47β、Y47A+Y35β、Y35A+Y35β、Y35A+Y47β诱导的症状均不相同，可能是由于β卫星编码的βC1具有症状决定因子和基因沉默抑制子的功能，可以多途径突破寄主的防御机制，为病毒的成功侵染创造有利条件，且两种β卫星的致病性均较强，强烈抑制寄主基因沉默所致的复合效果。但是在侵染后期，其诱导的症状则与Y35A+Y35β引起的症状相似，观察不到黄脉现象，而曲茎、皱缩矮化等症状依然明显。特异性检测结果表明，在整个病毒侵染过程中，从所有的感病本氏烟中均可以扩增到Y35A和Y35β的特异条带，表明这两种组分均在整个侵染过程中一直稳定复制，而在侵染后期Y47A和Y47β组分丢失，说明在本氏烟中Y35A和Y47A之间存在复制竞争作用，而Y47A一旦丢失，Y47β也将随着Y35A对Y35β特异性选择复制而最终丢失。病毒是一类严格的专性寄生物，双生病毒复制必须依赖寄主细胞提供DNA聚合酶及其相关辅助因子，才能在寄主细胞中进行自我复制，即双生病毒及其伴随的β卫星均需要在寄主细胞的支持下进行复制[118]，因此推测两者在利用寄主的复制系统这一资源时也存在着竞争。qPCR分析结果与特异性检测结果相似，Y47A和Y47β的病毒积累量在侵染的不同时期整体上呈现下降趋势，且均在第90d病毒的积累量有一个急剧的下降，与此相反，Y35A和Y35β的积累量在侵染时期整体上呈现上升趋势，并在第90d达到最高值。这表明Y47A/Y47β与Y35A/Y35β在本氏烟中的互作呈现复制竞争性，且在第90d达到高峰，竞争的结果是Y47A和Y47β的积累量急剧下降，而Y35A和Y35β组分的积累量达到最高值。由于两者的竞争作用，表现为Y35A和Y35β抑制了Y47A和Y47β的侵染，导致Y47A和Y47β在接种后期消失，因而接种本氏烟表现的症状逐渐与Y35A+Y35β引起的症状相似。由于Y47β是诱导黄脉症状的必需因子，因而到后期接种植株观察不到黄脉现象。这种竞争作用可能是一种进化适应的结果，Y47A/Y47β后期丢失，从而减轻复合侵染症状，增加两种病毒在自然界传播的几率；也可能激发了寄主植物对病毒入侵的抗性。有报道辣椒金色花叶病毒(Peppergoldenmosaicvirus,PepGMV)侵染辣椒引起的症状严重，而瓦斯蒂克辣椒病毒(Pepperhuastecovirus,PHV)单独侵染辣椒引起的症状轻，PHV与54 第五章MYVV/MYVB和TbCSV/TbCSB之间的互作研究PepGMV复合侵染表现拮抗性导致其诱导症状减轻，但目前在墨西哥的大多数发病作物上这两种病毒多表现为复合侵染，说明PepGMV与PHV的复合侵染比单独侵染更具扩展优势[119]；相反，具有引起严重症状或致死性的病毒在自然界不易扩展。有研究表明[55]，与Y47A具有同致病类型的Y10A，伴随同源β卫星与Y35A+Y35β同时侵染本氏烟时不表现拮抗作用，而且症状较严重，并在侵染整个时期均能检测病毒及卫星的存在，而接种Y35A+Yl0A+Y35β+Y10β的心叶烟中，Yl0A及Y10β则在后期相继丢失，表明病毒复合侵染作用表现为协生还是拮抗，可能与病毒致病类型无关，而与寄主某种致病途径有关，以待后续研究。对接种本氏烟植株60d后Y47A的复制水平进行分析，Y47A在接种Y47A+Y47β的本氏烟中积累量最高，再次证明β卫星与同源辅助病毒之间的互作特异性比与异源辅助病毒之间特异性更强。55 西南大学硕士学位论文56 第六章结论与展望第六章结论与展望1.研究主要结论1.1MYVV伴随同源和异源β卫星时在本氏烟上诱导的症状不同，表明症状的差异是由β卫星引起的。1.2运用所建立的实时荧光定量PCR体系检测表明，当β卫星存在时，辅助病毒MYVV的积累量显著提高，表明β卫星可以迅速增强病毒的积累水平。伴随同源β卫星时辅助病毒的积累水平高于其伴随异源β卫星，表明辅助病毒与同源β卫星之间的互作特异性比与异源β卫星之间的特异性更强。1.3当MYVV和TbCSV同时伴随其β卫星侵染本氏烟时，在侵染前期引起的症状比一种病毒及其β卫星单独侵染更严重，而在侵染后期，接种植株表现的症状与TbCSV/TbCSB引起的症状相似；PCR及实时荧光定量PCR检测结果表明在侵染后期MYVV和MYVB丢失。这些结果表明在本氏烟中TbCSV和MYVV之间存在拮抗作用。2.展望本研究明确了MYVV与TbCSV及其伴随卫星各组分间在本氏烟上的互作关系。有报道在不同寄主中，病毒及其伴随卫星各组分的互作关系不同，因而在本研究所得结果的基础上可进一步开展MYVV与TbCSV及其伴随卫星各组分在不同寄主上的互作关系，研究结果可望为探索和深入了解不同致病类型的双生病毒之间的相互作用提供理论依据。57 西南大学硕士学位论文58 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西南大学硕士学位论文64 附录A：本论文所用缩写词中英文对照附录A：本论文所用缩写词中英文对照英文缩写英文名中文名AcronymEnglishnameChinesenameAmpamplicillin氨苄青霉素ATPadenosine-triphosphate腺嘌呤核苷三磷酸bpbasepairs碱基对CPcoatprotein外壳蛋白CTABhexadecyltrimehtylammonium十六烷基三甲基溴化铵DNAdeoxyribonucleieacid脱氧核糖核酸dNTPDeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核酸三磷酸hrhour小时IPTGIsopropylthio-β-galactosidebovine异丙基硫代-β-半乳糖苷IRintergenicregion基因间隔区KbKilobase千碱基LBLuria-BertanimediumLB培养基Mmol/L摩尔/升minminute分钟MPMovementprotein移动蛋白ntnucleotide核苷酸ORFopenreadingframes开放阅读框PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应RCArollingcircleamplification滚环复制RdRPRNAdependentRNApolymerase依赖于RNA的RNA聚合酶REnreplicationenhanceprotein复制增强蛋白Repreplication-associatedprotein复制相关蛋白SSecond秒qPCRReal-timefluorescencequantitativePCR实时荧光定量PCRTrAPtranscriptionalactivatorprotein转录激活蛋白WTGwhitefly-transmittedgeminivirus粉虱传双生病毒BetaineGlycocollbetaine甜菜碱5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖X-gal5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside苷65 西南大学硕士学位论文66 附录B：常用缓冲液、培养基及抗生素配方附录B：常用缓冲液、培养基及抗生素配方CTAB抽提缓冲液(2%(w/v)CTAB，100mMTris.Cl,20mMEDTAPH8.0，1.4mol/LNaCl)NaCl82gCTAB20g1MTris.Cl(pH8.0)10ml0.5MEDTA(pH8.0)40ml加水定容至1000ml，调PH至8.0，于4℃保存CTAB/NaCl溶液(10%CTAB/0.7mol/LNaCl)在60mlH2O中溶解4.1gNaCl,缓慢加入10gCTAB(十六烷基三乙基溴化铵)，同时加热65℃并搅拌直至完全溶解。最终定容终体积至100ml。室温保存即可。CTAB沉淀液（50mmol/LTris.Cl,10mmol/LEDTA,1%(w/v)CTAB）CTAB10g1MTris.Cl(pH8.0)10ml0.5MEDTA(pH8.0)20ml加水定容至1000ml,调PH至8.0于4℃保存LB液体培养基（Yeastextract5g/L，Tryptone10g/L，NaCl5g/L）Yeastextract5gTryptone10gNaCl5g加950ml蒸馏水溶解，用5N氢氧化钠调pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌。LB固体培养基向1000ml液体LB培养基中加入15g琼脂粉，高压灭菌常温保存即可。10%SDS100gSDS溶入900ml水中，加热至68℃溶解，加几滴浓盐酸调PH至7.2，定容至1000ml分装，保存。67 西南大学硕士学位论文68 致谢致谢论文初稿完成已有一段时间，在之前的几次初稿中，我的致谢部分总是空着的，因为我清楚地明白，写完这部分后我离毕业就很近了。论文的写作过程是漫长痛苦的，但在写完那一刻，我已没了疲惫，也没有长舒一口气，而是百感交集。三年的求学生涯将划上一个句号，我最美好的学生时代也将关上大门，从此，我将真正走出校门、踏进社会。三年的研究生生涯转瞬即逝，回首在西南大学度过的学习生活，心中充满了对老师、同学、朋友和家人的无限感激之情，留下的是那些美好的记忆和难忘的经历。首先，我要感谢我最敬慕的导师青玲教授。我的导师，亲切和善，关心学生无微不至、平易近人；学识渊博，对专业孜孜不倦、精益求精；百忙之余仍然读书不辍、兢兢业业；为人师表，率先垂范；传道授业，循循善诱、披星戴月。我从您那里学会的不仅是怎样做好学问，更多的是我从您那里领略了为人处事的道理。虽然仅仅接触了三年，但您跟我的每一次交谈、您对我们的每一次教诲、甚至是您的每一个小举动，我都铭记在心。这三年在实验室生活中，您给予的支持和理解，让我非常感动，能有您这样一位亦师亦友的导师，是我最为幸运的事。作为一个女孩子来说，您在个人工作，待人接物，家庭生活，每个方面都是我学习的榜样。在这师恩情谊重如山，值此毕业之际，谨向您表达最由衷的敬意及诚挚的感谢！感谢植物保护学院对我的培养。在此要感谢孙现超、肖崇刚、谭万忠、毕朝位、杨水英、余洋、吴根土（土哥）等各位老师在论文开题、中期报告所提出的宝贵意见；感谢已毕业的熊艳师姐、阮涛师兄、春艳师姐（小妈妈）、张宁师姐（会长）、李茵师姐、史梦蝶师姐、刘陈晨师姐、赵城钢师兄、黄娅师姐、曹刘素师姐、赵雪君师姐、时洪伟你们对我实验的指导，疑难解答方面提供的支持与帮助；特别感谢李科师兄-中国好师兄，在整个三年时间里对我不厌其烦的指导和帮助；感谢杜江师兄，感谢荆陈沉（好管家）、任江平、孙淼、魏周玲、张旺、邓永杰、楚成茹（肉肉）、刘慧芳、郑桂贤、余化斌、陈思敏、潘琪、彭浩然、桂小健（小师叔）、罗信福、孔斌、龚卓群、吴红跃等这群可爱的师弟师妹们，你们让我在实验室生活更加的快乐和开心，同级的杜利娟、刘伯志、刘世超、肖继芬、刘旭旭、亲爱的秋言与你们一起学习，一起作报告，一起探讨实验，相互鼓励，我才能顺利完成实验内容，如今我们即将走出校园，只希望你们都能过得开心、幸福；感谢我的宿舍好友吴怡蓓、穆宁、秋月以及来自内师的兄弟姐妹罗茜、曾晓芸、贾敏、杨欢、郑洁，你们与我共同分担这三年的快乐与忧愁，你们是我生命历程中宝贵的财富和精神支柱。感谢我的那帮多年来陪我疯，陪我笑，陪我哭的家乡的69 西南大学硕士学位论文挚友，我永远爱你们！特别感谢我的父母和家人，你们给我的爱让我成长的无忧无虑，一直让我做一个幸福的人，对你们的爱和感激用文字难以完全表达，希望以后我们能更加的相亲相爱！此外，感谢时洪伟同学对我的耐心和支持，让我体会到什么叫后悔没有早点遇到你，请以后不要缺席我的未来。最后，我衷心感谢在百忙之中评阅我论文及参加论文答辩的各位专家！再次向那些曾经给予我帮助的人们表达最诚挚的感谢！2016年5月于西南大学植物保护学院病毒实验室70 在学期间发表和已录用论文及参加课题在学期间发表和已录用论文及参加课题发表论文1、Y.Hu,H.W.Shi,C.C.Jing,K.Li,X.C.Sun,G.T.Wu,C.Y.ZhouandL.Qing.FirstReportOfCucumberMosaicVirusInfetingAppleInChina[J].JournalofPlantPathology,2016,98(1):181.2、桂小健，胡燕，曹刘素，李科，青玲.赛葵黄脉病毒实时荧光定量PCR体系的建立[A].2014年中国植物保护学会学术年会论文集[C].中国植物保护学会2014,1:413.参加课题四川省粉虱传双生病毒病害复合体的遗传多样性、致病性变异以及DNA分子互作研究，国家自然科学基金(30971897)71