肝干细胞和肝癌细胞β-catenin蛋白表达及诱导分化实验的研究

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1、第三军医大学博士学位论文肝干细胞和肝癌细胞β-catenin蛋白表达及诱导分化的实验研究姓名：金世龙申请学位级别：博士专业：外科学（普外）指导教师：刘宝华20060501第三军医大学博士学位论文肝干细胞和肝癌细胞p—catenin蛋白表达及诱导分化的实验研究摘要肝部分切除后肝叶增大直至恢复原肝的质量、慢性乙型病毒性肝炎后期的结节性肝硬化和肝癌切除术后癌的复发(可能是转移灶)等现象均表明肝脏具有很强的再生能力，生长因子和细胞因子启动和调控肝脏再生。参与肝再生的成体肝干细胞(adulthepaticste

2、mcells，DHSC)是肝细胞发育、增殖、分化和癌变等生理、病理过程中的关键角色。最近的研究发现wnt信号途径关键蛋白B．catenin直接参与靶基因的转录和细胞间的粘附，不仅是细胞增殖和分化的强力调节因子，而且促进干细胞(stemcell)的维持和自我更新、干细胞特化和影响细胞系命运决定。wnt信号途径在干细胞发育，包括增殖、分化、调节等过程，和在肝及结肠癌发生、发展和转移过程中也发挥非常重要的作用。肝干细胞(hepaticstemcell，HSC)具有分化成肝细胞和胆管上皮细胞的双向分化潜力。肝

3、干细胞可能有三种去向：(1)通过自我更新，生成新的干细胞；(2)分化或演变为肝细胞、胆管细胞；(3)肝干细胞和肝癌细胞具有相同的肝脏微环境，在肝癌的模型和临床病理中发现癌组织和癌旁组织含有肝干细胞。研究提示，分化程序错误可能诱发肝癌，也就是说肝癌细胞来源于肝干细胞。新近研究发现wnt信号途径不仅调控干细胞增殖、分化，也调控癌干细胞(cancerstemcells，CSC)的增殖与分化。尽管wnt信号和肝干细胞如此重要的作用，但是肝干细胞是否存在wnt信号途径的作用很少有人进行研究，肝癌细胞浆和胞核D—

4、catenin表达及分布目前的免疫组化检测方法也不准确，很少有人对比性研究肝干细胞和肝癌细胞p—catenin表达和诱导分化方面的差异。因此，我们研究了肝干细胞和肝癌细胞p．catenin表达，细胞内分布和诱导分化条件下两种细胞形态、生长曲线、细胞分泌白蛋白和AFP功能及p—catenin分布的差异，探讨wnt信号在肝干细胞分化与增殖，肝癌细胞增殖作用的差异性。目的：1．摸索较为经济实用的肝干细胞的分离培养及鉴定分析方法。通过建立大鼠肝卵圆细胞的增殖模型，采用胶原酶消化法分离卵圆细胞，再经过Perc0

5、11密度梯度离心纯化，分离出肝卵圆细胞。进行培养和肝干细胞标志物鉴定，期望得到下步试验所需要的肝干细胞，进一步研究肝干细胞定向诱导向肝细胞和胆管细胞分化的细胞形态学变第三军医大学博士学位论文化规律。2．通过对wnt信号途径的关键分子D—catenin在肝干细胞和肝癌细胞的表达及细胞内分布的比较，研究wnt信号在肝干细胞和肝癌细胞分布的差异及其对细胞增殖、分化作用的关系。证实wnt信号途径对肝卵圆细胞增殖及分化的调控作用。3．通过肝干细胞和肝癌细胞在诱导分化前后细胞形态、生长曲线、细胞分泌白蛋白和AFP

6、功能变化，及p．catenin分布的差异比较，研究p．catenin在肝干细胞和肝癌细胞增殖和分化中发挥的作用。方法：用AAF厂PH建立了大鼠肝卵圆细胞增殖模型，用胶原酶消化法自大鼠AAⅣPH模型中分离单个肝卵圆细胞，经过Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞悬液，细胞悬液接种于O．2％明胶处理的含10％胎牛血清和含SCF20ng／ml，HGF10ng／ml，EGF10ng／ml，LⅢ10n∥ml的DMEM／F12培养液的培养瓶进行增殖培养。新分离的肝卵圆细胞用免疫荧光和westemBlotting检测

7、c—kit干细胞抗原，RT-PcR法检测其cKl9和白蛋白抗原，对肝卵圆细胞进行鉴定。采用免疫细胞化学，免疫组织化学和w．esternB10tting技术检测B—catenin在肝干细胞和肝癌细胞的表达及其细胞膜、细胞浆和细胞核分布，比较肝干细胞和肝癌细胞表达和细胞内分布的差异性。用含生长因子SCF20ng／“，HGF10ng／m1，EGF10ng／ml，地塞米松1．O×10—mol／L，1．5％DMSO，HSs20ng／m1的诱导培养液对进行肝干细胞及肝癌细胞株的诱导分化，观察诱导分化前后两种细胞形

8、态变化和D—catenin表达和细胞表达及分布的变化。结果：1．成功制造了大鼠AA聊H肝卵圆细胞增殖模型，部分肝切除手术后11—12d取肝，经过胶原酶Ⅳ消化肝组织和Percou梯度离心肝细胞悬液等相对简单的方法提纯肝卵圆细胞，所得细胞存活率90％，细胞数1．O×105～1．O×106／ml。新分离的肝卵圆细胞大小基本均匀，为卵圆形，其直径相当于成熟肝细胞1／4～l／6。免疫荧光技术和免疫印迹分析显示新分离的肝卵圆细胞有c．kit抗原表达，而成熟的肝细胞和