骨髓源性肝干细胞的筛选、扩增与诱导分化的研究肝癌术后肝再生状态与肝癌复发关系的初步研究

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1、中山大学博士后流动站博士后研究报告第一篇骨髓源性肝干细胞的筛选、扩增及诱导分化的研究摘要肝炎、肝硬化及肝癌等肝脏疾病所致的终术性肝功能障碍，目前最有效的治疗手段是原位肝移植(OLTl。然而，由于供体匮乏、免疫排斥和高额费用等问题，原位肝移植的广泛应用受到了限制。肝细胞移植(HTx)和生物人工肝技术(BAL)是目前建立的替代治疗方式。与OLT相比，HTx和BAL具有操作简单、可重复进行、供肝细胞免疫源性较低且可冻存、移植失败或产生免疫排斥对受体影响小、治疗费用低等优点。理论上来讲，HTx和BAL在许多方面已经具有代替原位肝移植的潜在优势，但事实上，HTx和BAL的I临床应用远未达到理论

2、上的预期效果，存在一些亟待解决的问题，其中肝细胞来源缺乏是制约这两种治疗方式发展的重要因素。目前的研究方向有永生化肝细胞和肝干细胞。由于永生化肝细胞是由病毒致癌原转染而来，对机体有许多不确定的影响，目前尚未能对其应用进行评估。而干细胞由于具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能，为肝细胞移植及生物人工肝技术展示出诱人的前景。肝干细胞的供源研究有肝源性的的肝干细胞(LSC)或肝祖细胞(HPC)以及非肝源性肝干细胞，前者包括卵圆细胞和小肝细胞，后者包括胚胎干细胞(ESC)、胰源性肝干细胞(PDLSC)和骨髓源性肝干细胞(BDLSC)。这些干细胞源，均已证实具有向肝实质细胞分化的潜能，但各有

3、其优缺点。从细胞特征、供体来源以及分离培养的特点等方面看，BDLSC具有易于调控、供源丰富、容易获得、可从自体获取、避免免疫排斥等优点，是较为理想的肝干细胞来源。BDLSC的研究，目前只是证实了它的存在以及转化能力，还不能进入应用研究阶段，原因之一在于骨髓内的细胞群体非常复杂，至今尚未发现可直接鉴定BDLSC的特征性表面标志，其在骨髓干细胞衍生过程中的具体谱系定位也不清楚，以至对其的分离纯化存在困难。目前鉴别BDLSC的研究方法，需要分析新的原始细胞标志或者新的干细胞群体，尽管有利于对骨髓内细胞群体的精确划Ill佛山市第一人民医院肝胆外科蔡云峰分，却导致了对肝干细胞识别和分离的困难，

4、而且实用性不强。鉴于成体干细胞的增殖需要环境刺激的特征，肝干细胞的增殖需要肝再生的微环境，而我们的前期工作发现适合肝干细胞增殖的肝损伤病理微环境是其它骨髓细胞类型所不能适应的，由此本课题设想采用适者生存的原理，建立一套病理微环境的体外筛选培养体系，在这一培养体系中，只有适应这一环境的肝干细胞可以生存增殖，而其它类型的细胞则逐渐凋亡，从而达到从骨髓细胞的体外培养中直接筛选和扩增肝干细胞的目的，并进行体内外诱导分化，探讨I临床应用的可行性。【材料与方法】1．大鼠骨髓肝干细胞的筛选、扩增及体内外诱导分化的研究1．1筛选培养液的制备制备大鼠淤胆血清，培养液中加入不同浓度淤胆血清制备筛选培养液

5、。1．2筛选培养液浓度的确定常规原代培养全骨髓细胞，贴壁后以上述不同浓度筛选培养液培养，观察细胞凋亡以及分化细胞生长情况，确定最佳浓度(5％)。1．3BDLSC的筛选、扩增、传代、分化上法培养全骨髓细胞，以含5％淤胆血清的筛选培养液筛选，4d后可获得肝干细胞集落。继续加入筛选培养液培养3d，非肝干细胞凋亡。以扩增培养液进行扩增培养，待细胞进入快速增殖期后加入白血病抑制因子(LIF)抑制肝干细胞细胞的分化，长满培养瓶底后进行细胞传代。分化则去除LIF，采用分化培养液进行分化培养，获得分化细胞。1．4流式细胞仪检测传代细胞表面标志的稳定性取各代细胞及分化细胞消化液消化后获得单细胞悬液，流

6、式细胞仪检测细胞表面干细胞标志B2m，Thy一1，CD34，Fit一3，c-kit，IL-3R的表达情况，比较分化前后的差别。Tv中山大学博士后流动站博士后研究报告1．5分化细胞的肝细胞标志检测取分化细胞，免疫细胞化学检测白蛋白、AFP、CK8／I8；RT-PCR检测肝细胞核因子一1c【(HNF．1a)、肝细胞核因子一3p(HNF一3p)、白蛋白、AFP、CKl8、CKl9、转甲状腺蛋白(TTR)和细胞色素P450．2bl(CYP2b1)等肝细胞特征性蛋白的mRNA转录；电镜检查细胞超微结构。1．6分化细胞的肝细胞功能检测取分化细胞，行糖原染色，检测培养液尿素浓度的变化。1．7分化细

7、胞的体内移植研究取分化细胞，荧光示踪剂CFDASE标记后经门静脉及经脾脏移植至倒千里光碱+70％肝切除大鼠肝内，10d后观察移植细胞整合入肝板及在脾内生长情况。2．人骨髓肝干细胞的筛选、扩增与诱导分化的研究2．1筛选培养液的制各收集临床各种急慢性肝功能不全患者的血清，测定总胆红素及肝细胞生长因子浓度，按5％；0U入基础培养液，对人骨髓细胞进行培养，观察筛选培养效果，确定最佳的培养血清。2．2BDLSC的筛选、扩增、传代、分化上法培养全骨髓细胞，以筛选培养液