骨髓源性肝干细胞的筛选、纯化及体内外诱导分化的研究

《骨髓源性肝干细胞的筛选、纯化及体内外诱导分化的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中山大学博士学位论文骨髓源性肝干细胞的筛选、纯化及体内外诱导分化的研究姓名：蔡云峰申请学位级别：博士专业：普通外科学指导教师：陈积圣2003.5.8骨髓源牲j扦干纲腿懿瓣选、纯纯及体蠹姊诱导势纯静研究蔡云蜂骨髓源性肝干细胞的筛选、纯化及体内外诱导分化的研究摘要【Jl千炎、翳硬化及野短等骚睡疾瘸掰致的终寒投翳功裁障碍，目兹最有效的{治疗手段是原位肝移植(OLT)。然而，由于供体匮乏、免疫排斥和高额费用等问题，原使肝移穰的广泛应焉爨翻了隈带l。翳细麓移檀(HTx)麓嚣蘸建立静替代治疗方式之一，与OLT相比，HTx具有诸多优点，理谂上来讲，HT

2、x在许多方面已缀具有代替原位肝移植的潜在优势，但事实上，HTx的临床应用远未达到理论一已豹预麓效采，主要藤因在予移禳缀稳豹_来源班及缨礁农体肉酌增整遂丽个关键问题尚未能得到根本的解决。对于后者，“治疗性肝辩生”技术的建立将提供一个全新的解决方案；对于前者，El前的研究方向有永生化肝细胞和黪于缨熬。塞予永生像翳缨黥是由瘸毒致瘸擐转絷瑟寒，薅援体骞诲多不礁定的影响，目前尚未能对其应用进行评估。而干细胞由于具有自我更新、高度增戆和多向分化的潜能，为肝细胞移檬展示蹦诱入的前景。肝干缩魏酶珙深磷究有释添往的酶嚣于缁藤(LSC)或翳穰维藤(HPC)以

3、及非野源性黔于细胞，前者包括卵圆细臌和小肝细胞，后者镪括胚胎干细胞(ESC)、胰源性肝干细胞(PDLSC)和骨髓源性肝干细胞(BDLSC)。这些于缀腿源，海己诞实其蠢离jl手实质缨舞缝分诧懿潜戆，毽各蠢其霞缺点。铁缓嚣墼特征、供体来源以及分离培养的特点等方面看，BDLSC具有易于调控、供源丰富、容易获褥、可从自体获取、避免免疫排斥等优点，是较为理想的肝干细胞来源。BDLSC的研究，莓前袋是证安了它鹃存在驻及转优能力，还不麓进入纛用研究阶段，原因之一在于骨髓内的细胞群体非鬻复杂，至今尚未发现可直接黢定BDLSC的特征性表面标志，旗在骨髓干细

4、胞衍生过程中的具体谱系定位穗不清麓，激至对其瓣分离筑讫存程困难。蠢蓠签麓BDLSC静研究方法，鬣要分析新的原始细胞标志或者新的于细胞群体，尽管有利于对骨髓内纲胞群体的精确划分，却导致了对肝干细胞识别和分离的困难，而且实用性不强01V中山大学博L学位论文鉴于成体干细胞的增殖需要环境刺激的特征，本课题设想建立肝损伤的体内病理微环境，通过研究BDLSC在肝病理微环境下的动员来识别其群体特征，从而筛选、纯化、扩增和体内外诱导分化BDLSC，探讨其动员分化的调控机制以及临床应用的可行性。，1【材料与方法】＼1．骨髓源性肝干细胞的动员1．1动物肝损伤

5、模型的建立取SD大鼠分组，建立50％肝切除、70％肝切除、淤胆、2．乙基氨基芴+四氯化碳等肝损伤模型。1．2肝功能测定动物模型建立lO天后，取血测肝功能各项指标，观察肝损伤情况。1．3检测骨髓干细胞群体数量变化处死动物，制备骨髓细胞悬液，与荧光抗体结合后流式细胞仪检测Ibm一，Thy—l+，CD34+，Flt-3+，IL．3R+，c．kit+等干细胞群体所占的百分率。观察干细胞群体的数量变化，寻找BDLSC的标志。2．BDLSC的分离与体内外诱导分化的研究2．1免疫磁珠法(MACS)分离骨髓干细胞制备骨髓细胞悬液，与相应一抗、分离132m

6、一，Thy-1+，CD34+，Flt-3+，结合磁珠的二抗孵育，通过MACS磁场IL一3R+，c．虹t+等细胞群体。2．2骨髓干细胞培养、诱导分化为肝细胞样细胞采用含5％淤胆血清和肝细胞生长因子(HGF)的培养液诱导分化上述干细胞群体，观察细胞形态的变化，检测肝细胞特征性蛋白的表达。2．3治疗性肝再生模型的建立及肝干细胞脾内移植V骨髓源性肝干细胞的筛选、纯化及体内外诱导分化的研究蔡云峰建立倒千里光碱+70％肝切除模型，将上述干细胞移植至脾内，2周后取脾行HE及免疫荧光检测。2．4免疫细胞化学染色及免疫荧光检测体外培养诱导分化的细胞行免疫细

7、胞化学检测，脾内移植细胞分化后行免疫荧光检测。检测指标：白蛋白、AFP、CK8／18。3．病理微环境筛选体系从骨髓细胞中直接筛选与扩增肝干细胞3．1筛选培养液的制备培养液中加入不同浓度淤胆血清制备筛选培养液。3．2筛选培养液浓度的确定常规原代培养全骨髓细胞，贴壁后以上述不同浓度筛选培养液培养，观察细胞凋亡以及分化细胞生长情况，确定最佳浓度(5％)。3．3BDLSC的筛选、扩增、分化上法培养全骨髓细胞，以含5％淤胆血清的筛选培养液筛选，4天后加用HGF，观察细胞生长、分化情况。3．4分化细胞的肝细胞标志检测取分化细胞，免疫细胞化学检测白蛋白

8、、AFP、CK8／18；RT-PCR检测肝细胞核因子-la(HNF—let)、肝细胞核因子-3p(HNF一3p)、白蛋白、AFP、CKl8、CKl9、转甲状腺蛋白(TTR)和细胞色素P450．