猪传染性胃肠炎病毒s基因抗原位点区的表达及其优化

《猪传染性胃肠炎病毒s基因抗原位点区的表达及其优化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号；Q!§uDc：量21密级：公珏堡学校代码：10712研究生学号：SY20040991⑧西北农林针捉大学2007届攻读硕士学位研究生学位(毕业)论文猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点区的表达及其优化学科专业筮直生塑堂研究方向嘘塾动物廷照王捏研究生昌宝指导教师张涵麴援完成时间2壁Q2笙鱼旦中国陕西杨凌猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点区的表达及其优化摘要猪传染性胃肠炎(Transmissiblegast∞enteritisofswine，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritisviru

2、sofswine，TGEV)引起的一种高接触性传染病。在TGEV编码的四种结构蛋白中，只有纤突蛋白(S蛋白)能够诱导中和抗体的产生。而位于S蛋白近N端A、B、C、D四个主要抗原位点片段诱导产生的免疫保护作用，几乎相当于整个S蛋白产生的诱导效应。因此，对于S蛋白抗原位点区的研究可以为T(饱的诊断，预防提供一定的基础条件。本研究以S基因抗原位点区作为目的基因，将其克隆至原核表达载体pET-28a中，并转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株后，以IPTG诱导目的蛋白的表达。表达产物经SDS·PAGE电泳及Western-blot检测均与预期

3、结果相符的基础上，利用自动诱导表达系统进一步提高目的蛋白的表达量。相关结果如下：1．以带有全长S基因的质粒pGS为模板，通过PCR扩增2．1kb的S基因抗原位点片段S1。并将其定向克隆至原核表达载体pET-28a中，构建了pET-Sl原核表达重组质粒。2．将带有重组质粒pET-Sl的BL21(DE3)菌株，分别于37℃、30℃、28℃下诱导培养5h后，收集菌液稀释105倍，涂布含l洳a‘和无抗性的LB平板，经菌落计数表明，在37℃和30℃诱导时，分别约有60％和30％的大肠杆菌细胞丢失重组质粒；而28℃诱导则pET-SI在大肠杆菌B

4、L21(DE3)中可较稳定存在。SDS-PAGE电泳显示，37℃、30℃诱导条件下蛋白表达不明显，而将诱导温度降低至28℃时可明显提高目的蛋白的表达。3．在28℃条件下以IPTG诱导目的蛋白表达。经SDS．PAGE电泳及Western-blot检测表明，目的蛋白产物大小与预期一致为76l【Il，并且具有天然蛋白抗原性。通过凝胶分析软件Bandscan分析显示，随培养时间的增加，目的蛋白表达量逐渐增加，最高约占细菌总蛋白的25．9％。未诱导的对照组也有少量目的蛋白的表达，约占菌体总蛋白的3．3％。4．分别设置pET-S1转化菌的诱导组

5、和未诱导组，通过测定菌液振摇培养相同时间的OD600值表明，未诱导组在振摇培养初期菌液的OD600值可达到3．65，最高可达到6．19：而诱导组菌液的OD600值最高只可达到2．68，由此说明诱导开始后菌株的生长在一定程度上受到了限制。5．利用自动诱导表达系统，通过重新定义菌株复苏生长以及目的蛋白诱导表达时的培养基组分，使目的蛋白表达量提高到45．1％。6．以IPTG诱导作为对照，pET-S1转化菌在自动诱导培养基中振摇培养12h。菌液的OD600值和pH值表明，在玎盯G诱导体系中，茵液OD600最高仅达到2．63，并且随诱导时间增

6、加，菌液有逐渐偏碱性的趋势；反之在自动诱导体系中，菌液的OD600值最高可达到12．65。而pH值在振摇培养过程中基本接近中性。关键词：猪传染性胃肠炎病毒；S基因；抗原位点；异丙基-B-D-硫代半乳糖苷；自动诱导表达EXPRESSIONANDOPT呱ⅡZATIONOFT曰EFRAGⅣ匝NTINCLUDINGSGENEWHOLEANⅡG．ENICSITESOFSWINETRANSⅦSSmLEGASTRoENTERITISCORONAVⅡ℃I7SABSTRACTTransmissiblegastroenteritisofswinefrO

7、E)whichisCaUSedbytransmissiblegastroenteritisvirusofswinefrGEV)isallacute，highlrprevalententericinfectiousdisease．TGEVhavefourmajorStnlctt砌proteins．ThemajorantigenicsitesofTGEVinvolvedintheinductionofvirusneutralizangantibodiesarelocatedintheglobularportionoftlaespike(

8、S)protein．111eSproteinofTGEVhasfourmajorantigenicsites．whiela锄induceilllmllileprotectingeffectsassameasthewholeSprote