碳纳米管对视网膜色素上皮细胞的毒性研究

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1、温州医学院硕士学位论文碳纳米管对视网膜色素上皮细胞的毒性研究姓名：张舒申请学位级别：硕士专业：眼科学指导教师：陈浩；晏露；刘勇2012-05温州医学院硕士学位论文碳纳米管对视网膜色素上皮细胞的毒性研究中文摘要实验目的：随着碳纳米管在生物医学领域应用研究的逐步发展，碳纳米管的生物毒性问题越来越受到科学家们的关注。在碳纳米管的实际应用和研究过程中，眼部与其接触是不可避免的，因此，探讨和研究碳纳米管的眼用安全性意义重大。本研究以人类视网膜色素上皮细胞株(ARPE．19)作为模型细胞，研究探讨了碳纳米管(carbonnanotubes，CNTs)及其表面分别接枝羧基和羟基后对细胞

2、造成的损伤程度，为碳纳米管作为眼科药物和基因治疗载体的潜在应用提供保障。实验方法：本实验选用2种不同的碳纳米管，即单壁碳纳米管(Single．walledCarbonNanotubes，SWCNT)和多壁碳纳米管(Multi．walledCarbonNanotubes，MWCNT)。研究了这两种碳纳米管在四个浓度梯度下(5rtg／ml、10}tg／ml、50I-tg／ml、100Irtg／m1)分别与ARPE-19共同培育24h、48h和72h后致细胞损伤的程度。我们通过倒置相差显微镜观察了细胞形态变化；采用CCK．8方法检测了细胞存活率；同时运用乳酸脱氢酶(LDH)试剂

3、盒评估了碳纳米管孵育后细胞膜的完整性；利用2，7二氯荧光黄双乙酸盐法检测了碳纳米管对ARPE．19细胞内活性氧(ROS)含量的影响；采用Hoechst染色试剂盒来检测细胞凋亡的形态及数目；另外通过透射电子显微镜观察了ARPE．19细胞对碳纳米管的摄入及其在细胞内的定位情况。由此分析了碳纳米管对ARPE．19细胞的生物相容性。实验结果：1．单壁碳纳米管(SWCNT)对ARPE．19细胞的毒性影响1)细胞形态观察：通过倒置相差显微镜下的观察发现，经单壁碳纳米管处理的ARPE一19细胞的形态发生了一定程度的改变。相对于正常细胞，单壁碳纳米管处理后细胞微绒毛有所减少，其延展性、贴

4、壁性能稍差，但细胞生长并未受到显著抑制，也没有表现出明显的死亡现象。2)CCK．8法检测结果显示在高浓度时SWCNT．COOH对细胞的损伤程度要小于SWCNT．OH和SWCNT。3)含单壁碳纳米管的细胞培养液上清液中LDH含量有所升高，但高浓度时却有所降低，SWCNT．COOH处理后的ARPE．19细胞中释放的LDH的含量是最低的。4)单肇碳纳米管诱导细胞内ROS升高的次序依次为SWCNT>SWCNT-OH>SWCNT．COOH：温州医学院硕士学位论文5)Hoechst33258染色后表明单壁碳纳米管诱导细胞凋亡不明显；6)通过透射电子显微镜观察到部分SWCNT．COOH

5、被AI冲E．19细胞吞噬，细胞出现损伤现象。2．多壁碳纳米管(MWCNT)对ARPE．19细胞的毒性影响1)细胞形态观察：通过倒置相差显微镜下的观察发现，经多壁碳纳米管处理过的ARPE．19细胞比单壁碳纳米管处理过的ARPE．19细胞生长状态好，细胞的延展性、贴壁性仍然较好。2)CCK．8法检测结果显示在低浓度时MWCNT．COOH对细胞的损伤程度要小于MWCNT．OH和MWCNT，总的来说，多壁碳纳米管比单壁碳纳米管处理后的细胞存活率高；3)含多壁碳纳米管的细胞培养液上清液中LDH含量也有所升高，MWCNT．COOH处理后的ARPE．19细胞中释放的LDH的含量也是最低

6、的，且LDH释放量比单壁碳纳米管处理后的低：4)多壁碳纳米管诱导细胞内ROS升高的次序依次为MWCNT>MWCNT．OH>MWCNT-COOH；5)Hoechst33258染色结果与功能化单壁碳纳米管结果一致：6)通过透射电子显微镜也观察到部分MWCNT．COOH进入ARPE一19细胞内，且细胞损伤不明显。实验结论：表面功能化的碳纳米管展现了比未改性的碳纳米管更好的眼部细胞生物相容性。多壁碳纳米管展现了比单壁碳纳米管更好的生物相容性。研究结果表明，羧基化的多壁碳纳米管更具有作为治疗眼底疾病药物或基因载体潜在可能性。关键词：功能化；碳纳米管；ARPE-l9细胞；细胞毒性St

7、udyonCytotoxicityofCarbonNanotubeswithHumanRetinalPigmentEpitheliumCellsAbstractPurpose：Withincreasingdevelopmentofcarbonnanotubes(CNTs)invariousapplicationareasparticularlybiomedicine，theirbiologicalsafetyandinfluenceonenvironmenthaveattractedmoreandmoreattentions．