急性单核细胞白血病thp-1细胞系白血病干细胞的分选、鉴定及靶向治疗的初步研究

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1、郑州大学博士学位论文急性单核细胞白血病THP--1细胞系白血病干细胞的分选、鉴定及靶向治疗的初步研究姓名：王颖超申请学位级别：博士专业：儿科学指导教师：盛光耀201204中文摘要急性单核细胞白血病THP．1细胞系白血病干细胞的分选、鉴定及靶向治疗的初步研究博士研究生王颖超导师盛光耀教授郑州大学第一附属医院儿科河南郑州450052白血病(1eukemia)是以骨髓和／或外周血中幼稚细胞增多为特征的血液系统恶性克隆性疾病，白血病干细胞(1eukemiastemcell，LSCs)在白血病发生、发展、耐药和复发等方面起重要作用。只有靶向消灭白血病干细胞，才能彻底治愈白血病。因

2、此，识别和清除白血病患者体内的白血病干细胞，对了解白血病成因及治疗具有重要意义。流式细胞仪细胞技术具有精确度高，速度快等特点，是研究白血病细胞中干细胞分选、LSCs生物学特性的强有力工具。THP．1细胞株是从一个急性髓细胞白血病(acutemyeloidleukemia，AML)男性患儿的周围血培育出的，为儿童AML的实验和临床前期研究提供了很好的模板。阿糖胞苷(Ara．C)是白血病临床治疗常用药物，主要通过抑制细胞DNA的合成，干扰S增殖期细胞的增殖，而对处于静止期(G0期)的LSCs无效。所以，迫切需要新的治疗策略，以提高白血病的不良预后。本课题旨在探讨急性单核细胞

3、白血病THP．1细胞系中LSCs比例及生物学特性，并建立人THP．1白血病小鼠模型，探讨THP．1LSCs与非LSCs致瘤能力的差别，研究CD47在白血病中的表达特点，为LSCs清除寻找靶点。同时探讨抗CD47单克隆抗体单独或联合阿糖胞苷作用时的抗白血病效应，以寻找白T中文摘要血病靶向治疗新策略。第一部分急性单核细胞白血病细胞系THP．1白血病干细胞的检测、分选及鉴定目的：探讨人急性单核细胞白血病THP．1细胞株中是否存在白血病干细胞(LSCs)，并观察该LSCs细胞亚群与非LSCs细胞亚群在细胞周期、生长增殖情况、耐药性及耐药蛋白、凋亡基因表达差异，从而进一步鉴定LS

4、Cs细胞，了解其生物学活性及特性。方法：应用流式细胞术(FCM)N定THP．1细胞株中干细胞在对数生长期THP．1细胞中的比例，然后分选THP．1白血病干细胞，FCM分析该LSCs亚群与非LSCs亚群细胞周期。细胞生长曲线法和集落培养法比较LSCs亚群与非LSCs亚群细胞的增殖能力和集落形成能力。MTT法检测两亚群细胞对阿糖胞苷(Ara—C)敏感性。实时荧光定量PCR检测ABCG2、ABCBl耐药基因和Bcl．2、Bax凋亡基因在两亚群细胞中表达差异。结果：1．在白血病THP．1细胞株中存在免疫表型为CD34+CD38。的LSCs，比例为O．124-0．06％；收集分选

5、后LSCs管细胞再次上流式细胞仪进行LSCs细胞纯度检测示：细胞集中于之前的LSCs区域，比例高达97．0±1．7％。2．收集分选后的THP．1LSCs和非LSCs，流式细胞仪检测两群细胞各样本的细胞周期，可见在分选后的LSCs亚群中大部分的细胞处于静止期，C4Gl期比例达94．03±1．61％，明显高于非LSCs比例，差异有统计学意义；非LSCs亚群增殖期细胞比例相对较高，分别为S／G2／M期细胞比例为56．584-1．59％。3．LSCs和非LSCs细胞的生长曲线不同。在接种后的第1和2天，二者无明显差异，从第3天起LSCs细胞大量增加，快速增殖至指数生长期；非LS

6、Cs细胞生长、增殖缓慢，在第5天进到平台期。LSCs和非LSCs生长速度差异显著(PII中文摘要<0．05)。分选后的THP．1细胞及未分选的THP．1细胞进行集落培养96小时后显微镜下观察发现LSCs细胞集落形成率明显大于非LSCs组(P<0．05)，且每个集落细胞数量高于非LSCs组。4．在12．48小时各时间点，阿糖胞苷作用于THP．1LSCs细胞的IC50均高于非LSCs细胞，24小时对THP．1LSCs细胞的及非LSCs的IC50分别为216uM和149uM，48小时对THP．ILSCs的IC50值为198uM，非LSCs的IC50值为138uM(P=0．04

7、2)。5．实时荧光定量PCR结果显示：LSCs和非LSCs细胞亚群表达ABCG2的水平分别是9．014-1．12和0．654-0．04(尸<0．05)，表达ABCBl的水平同样高于非LSCs亚群(P<0．05)；LSCs亚群中，Bcl．2表达值为0．994-0．08，非LSCs亚群表达值为0．294-0．13，二者差异有统计学意义(P<0．05)；LSCs亚群中，Bax表达值为0．684-0．05，非LSCs亚群Bax表达值为O．85+0．09，统计学比较后，差异没有统计学意义(P>0．05)，但是Bcl．2／Bax比值显著高于非LSCs