急性单核细胞白血病细胞系thp-1侧群细胞的分选、鉴定与富集

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofmasterSorting，IdentificationandEnrichmentofSidepopulationCellsinAcuteMonocyticLeukemiaTHP--1CellLineByChuyunYinSupervisor：Prof．YingchaoWangDepartmentofPediatricsTheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMay,2012原创性声

2、明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：学位论文使用授权声明日期：伽胁}、弓D本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或

3、部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：融菇云日期：知肛、f．乡l／摘要急性单核细胞白血病细胞系THP．1侧群细胞的分选、鉴定与富集研究生：殷楚云导师：王颖超副教授郑州大学第一附属医院儿科河南郑州450052摘要研究背景与目的：肿瘤干细胞(Cancerstemcells，CSCs)理论从一个崭新的角度阐述了肿瘤的发病机制，该理论指出在肿瘤组织中存在极

4、少一部分在通常情况下处于静止期的肿瘤细胞，这些细胞除具有极其强的自我更新、增殖和分化能力外，还具有体内外高度致瘤能力，是驱动肿瘤形成和发展的最主要力量。CSCs因其自身特点能够抵御传统抗肿瘤药物的杀伤，成为肿瘤耐药和复发的根源。因此，只有靶向清除CSCs，才有可能彻底治愈肿瘤。白血病是儿童最常见的恶性肿瘤，CSCs首先在白血病的研究中得到了证实，白血病患者体内存在的CSCs也被称为白血病干细胞(Leukemiastemcells，LSCs)。CSCs已经成为医学领域的研究热点，希望通过研究CSCs，为肿瘤的靶向治疗提供新思路，如何寻找、

5、分离、获得高纯度的CSCs就显得尤为重要。侧群(Sidepopulations，SP)细胞具有干细胞的生物学特性，从肿瘤细胞中分离出的SP细胞富含CSCs。利用SP细胞能够高效率将荧光染料Hoechst33342泵出细胞外的特性，再结合流式细胞仪荧光激活细胞分选法是目前公认的分离CSCs的方法。白血病细胞系也具有体外无限传代的特性，本研究旨在检测人急性单核细胞、摘要白血病细胞系THP．1中是否存在SP细胞，对该SP细胞分选后探讨其是否具有LSCs活性及生物学特点，并探讨利用细胞周期特异性药物阿糖胞苷(Ara．C)从人白血病细胞系THP．

6、1中富集SP细胞的方法，为进一步认识LSCs奠定基础。研究方法：1．将对数生长期的THP．1细胞用Hoeehst33342染色，荧光显微镜观察THP．1细胞株中是否存在拒染或淡染的SP细胞，观察SP细胞的形态，计算SP细胞所占比例。并将Hoeehst33342染色后的THP．1细胞再应用流式细胞术检测，观察是否存在SP细胞及其所占的比例。2．流式细胞仪分选出THP．1细胞中sP细胞和非SP(NSP)细胞，并分析SP细胞和NSP细胞表面抗原(CD34、CD38)的表达及细胞周期；细胞生长曲线法和集落培养法比较SP细胞和NSP细胞的增殖能力

7、和集落形成能力：半定量PCR和实时荧光定量PCR检测ABCG2、ABCBl耐药基因和Bcl．2、Bax凋亡基因在两亚群细胞中表达差异。3．将对数生长期THP一1细胞用10p∥ml、100p∥ml、1000p∥ml、2000pg／m1分别相当体内用小剂量、常规剂量、中剂量和大剂量Ara-C的药物浓度处理24h，离心洗涤，Hoechst33342染色后，用流式细胞仪检测sP细胞比例的变化，从而对SP细胞进行富集。结果：1．将THP．1细胞用Hoechst33342染色后涂片，用倒置荧光显微镜在紫外光下观察，可见绝大部分细胞因被Hoechst

8、33342染色呈现强蓝色荧光(NSP细胞)，而仅有极少一部分的细胞呈现微弱蓝色荧光或不发光的细胞，这部分细胞就是SP细胞，在全部细胞中占(4．854-1．35)％，SP细胞及NSP细胞在形态学上无明显差异。