人鼻咽癌顺铂耐药细胞系cne2cr的建立及egcg逆转耐药机制研究

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文人鼻咽癌顺铂耐药细胞系CNE2／CR的建立及EGCG逆转耐药机制研究EstablishmentofaHumanNasopharyngealCarcinomaCisplatin—resistantCellLineCNE2／CRandInvestigationofMechanismsofEGCGasaResistanceReversalAgent课题来源：国家973计划项目(No．2010CB529400)专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席肿瘤学刘英肖广惠教授钟雪云教授答辩委员会成员姚开泰教授湛凤凰教授陈系古教授论文评阅人袁亚维教授贺志敏教授2012年0

2、5月20日广州硕士学位论文人鼻咽癌顺铂耐药细胞系CNE2／CR的建立及EGCG逆转耐药机制研究硕士研究生：刘英指导教师：肖广惠教授摘要研究背景肿瘤多药耐药(multi．drugresistance，MDR)在相当一部分接受化疗的肿瘤患者中都有发生，这一现象的出现严重影响化疗药物的疗效及肿瘤患者的预后。顺铂是治疗头颈肿瘤最有效的铂类药物之一，它通过与DNA交联来干扰细胞分裂、诱导凋亡，从而杀灭肿瘤细胞。在临床上常用顺铂联合其他化疗药物治疗肿瘤患者，但随之出现的多药耐药现象使得顺铂的疗效大大降低。鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)是中国南部及东南亚地区最常见的恶性

3、肿瘤之一，在很大一部分接受顺铂化疗的中晚期鼻咽癌患者中同样存在多药耐药现象。肿瘤干细胞(cancerstemcells，CSCs)是存在于肿瘤组织中的一小部分具有干细胞性质的细胞群体，它具有自我更新的能力，是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤不断扩大的源泉。肿瘤干细胞往往处于细胞分裂的静止期，并且可以有效地将药物排出胞外。现有治疗肿瘤的方法主要是针对肿瘤组织内的大多数增殖迅速的分化细胞，而无法杀灭肿瘤干细胞。在停止治疗后，肿瘤干细胞的再度活跃将导致肿瘤的复发。化学治疗过程中出现的多药耐药现象是导致化疗失败的主要原因，如何解决这一问题是目前抗肿瘤研究的热点，其中寻找多药耐药逆转剂(resista

4、ncereversalagents，RRA)是解决MDR问题的有效手段之一。流行病学研究结果显示，中文摘要绿茶对多种肿瘤均有防癌抗癌作用，其有效成分表没食子素没食子酸酯(epigallocatechingallate，EGCG)能通过多种途径抑制肿瘤的形成、生长和转移，并对肝癌MDR细胞具有一定的逆转作用。本课题是以鼻咽癌细胞为研究对象，通过体外诱导建立了人鼻咽癌耐药细胞系，并探讨其耐药机制；然后进一步利用EGCG联合化疗药物作用于耐药细胞系，如能有效逆转鼻咽癌细胞耐药，则可为解决临床上鼻咽癌患者多药耐药问题提供了一个可能的新途径。研究方法l、顺铂敏感细胞株的筛选：通过MTT实验筛选对化疗

5、药物顺铂较敏感的人鼻咽癌细胞株做为本课题实验研究对象。2、耐药细胞系的建立及耐药特征分析：采用大剂量冲击和逐步增加药物剂量相结合的方法诱导建立人鼻咽癌耐药细胞系；MTT法分别检测药物对亲代细胞及耐药细胞的半数抑制浓度(halfinhibitoryconcentration，IC50)，并计算耐药指数(resistanceindex，Rj)；倒置显微镜下对比观察亲代细胞及耐药细胞的形态学差异；通过流式细胞术(fluorescenceactivatedcellsorting，FACS)分别检测亲代细胞和耐药细胞的细胞周期。3、交叉耐药：通过MTT实验分别检测长春新碱、氟尿嘧啶、紫杉醇、氨甲蝶呤

6、、多柔比星及阿糖胞苷等细胞毒药物对亲代细胞及耐药细胞的敏感性，分析所建立的鼻咽癌耐药细胞系的多药耐药性。4、相关蛋白表达水平的检测：通过Westernblot实验检测亲代细胞和耐药细胞中耐药相关蛋白及上皮．间充质转变(Epithelial．MesenchymalTransition，EMT)相关蛋白的表达水平。5、耐药相关基因的mRNA表达水平的检测：实时荧光定量PCR(realtimequantitativePCR，QPCR)实验检测亲代细胞和耐药细胞之间的耐药相关基因的表达水平。6、鼻咽癌耐药细胞的肿瘤干细胞特性分析：通过流式细胞术分别检测亲代细胞和耐药细胞中侧群(sidepopula

7、tion，SP)细胞的比例，Aldefluor法检测II硕士学位论文ALDHl+细胞的多少和无血清悬浮培养法检测两组细胞肿瘤球形成率的高低。7、EGCG逆转耐药效率的检测：通过MTT法检测逆转剂EGCG逆转鼻咽癌细胞耐药的效率，并计算其逆转倍数(reversalfactor,Ⅺ)。8、逆转耐药机制的分析：通过对比检测单一用药及联合逆转剂用药后耐药细胞中细胞凋亡比例的改变，检测SP细胞及ALDHl+细胞比例变化。9、相关蛋