egcg对人耐药口腔表皮样癌细胞株耐药逆转的实验

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1、EGCG对人耐药口腔表皮样癌细胞株耐药逆转的实验作者：梁钢，林晓贞，唐安洲，黎莉，周铭【摘要】目的研究EGCG对人多药耐药口腔癌细胞KBV200的细胞毒增敏作用及裸鼠移植瘤的抑瘤作用。方法MTT法检测药物对细胞的毒性作用，流式细胞术分别检测细胞P糖蛋白的表达，HPLC检测细胞内VCR浓度，采用KB和KBV200细胞分别种植同一裸鼠左、右腋下，观察用药后体重、抑瘤率的改变。RTPCR检测瘤组织mdr1的表达。结果EGCG在100mg·L-1以下剂量对两株肿瘤细胞的抑制率均小于10%，EGCG与VCR联合应用可明显提高VCR的细胞毒作用；EGCG联合V

2、CR作用后KBV200细胞内VCR浓度升高，P糖蛋白的表达下降；EGCG可增加VCR对KBV200的抑瘤作用，可降低瘤组织MDR1的表达量。结论EGCG可增强VCR对多药耐药肿瘤细胞KBV200的细胞毒作用，机制可能与降低MDR1mRNA、Pgp表达，提高细胞内药物浓度有关。【关键词】多药耐药；P糖蛋白；耐药逆转剂；鳞癌　　0引言11口腔癌在世界范围内高发，居头颈部肿瘤第二位，是十大最低患者生存率肿瘤之一，原发多药耐药(Multidrugresistance，MDR)及继发MDR较为严重，常见机制是MDRl、LRP(Lungresistancer

3、elatedprotein,LEP)、MRP1(Multidrugresistancerelatedprotein,MRP)表达升高，导致相应胞膜或核膜蛋白表达增高[1]。如何解决以鳞癌、肝癌等为代表的实体瘤MDR问题是当前抗肿瘤研究的热点。目前MDR逆转剂多数为P糖蛋白（Pgp）功能抑制剂，如维拉帕米（Verapamil,VRP,Ver），临床上的VRP最大耐受浓度为2μmol/L,这一浓度在体外组织培养中不能逆转MDR，限制了临床的使用。到目前为止，二、三代多药耐药逆转剂（Reuersalagents,RRA）尚未成功应用于临床。因此在天然药物

4、中寻找高效、低毒RRA或改造已知RRA的化学结构以降低其毒性是主要研究方向。国内外研究绿茶提取物，特别是EGCG的抗肿瘤和逆转MDR作用，研究集中于逆转机制与MDR1或MRP1的关系，部分结果表明EGCG可通过抑止Pgp功能发挥逆转作用，而部分资料显示其逆转作用独立于Pgp和MRP2，体内实验较缺乏；我们前期已证实EGCG在体外可逆转人MDR肝癌细胞BEL7404/ADR的MDR作用[1]。本研究探讨EGCG体内逆转KBV200的MDR作用，为进一步发现新的多药耐药逆转剂和可能的作用靶点提供实验依据。　　1材料和方法　　1.1细胞与动物11人口

5、腔表皮样癌细胞株KB和KBV200由北京大学临床肿瘤学院许佐良教授惠赠。BALB/Cnu/nu裸小鼠（4～5周），体重（15±2）g，雌雄各半，购自上海斯莱克实验动物公司，饲养于SPF条件下。　　1.2药物及试剂盐酸长春新碱（VCR）购于上海华联制药有限公司；EGCG按专利CN1060488A分离得；MTT购自Sigma，RPMI1640、新生牛血清购自GIBCOBRL；抗PgpPE抗体:BectonDickinson；小量组织总RNA快速抽提纯化试剂盒购自北京华舜；FirststrandcDNAsynthesiskit、MassRulerT

6、MDNALadder购自MBI。　　1.3方法　　1.3.1细胞培养用含10%新生牛血清的RPMI1640培养液于37℃、饱和湿度、5%CO2环境中培养KBV200培养液中含有200nmol·L-1VCR以维持耐药性，用0.25%胰蛋白酶联合0.02%EDTA消化传代。　　1.3.2耐药倍数测定（MTT法）[2]11　　对数生长期细胞，制成（2～5）×105ml-1悬液，每孔100μl接种于96孔板，加入相应浓度的含药培养液，参照文献[2]，用酶联免疫检测仪检测波长570nm处的吸光度。细胞存活率＝（实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。由细

7、胞存活率与药物浓度作图，求出IC50值。逆转倍数＝逆转前耐药细胞IC50/逆转后耐药细胞IC50。MTT试验在不同日重复3次。　　　1.3.3高效液相色谱（HPLC）检测细胞对VCR的转运　　1.3.3.1细胞对VCR的被动转运用含15mM叠氮化钠、10mM脱氧葡萄糖和10％NBS的PBS(pH7.4)处理细胞15min，换用含1.91mg/L的VCR、或又含EGCG8mg/L的上述培养液孵育2h，冷PBS洗涤3次，用0.5ml冷三蒸水，-20℃反复冻融3次，取上清做HPLC分析。色谱条件及数据处理等详见文献[3]。　　1.3.3.2细胞对VCR的摄

8、入和外排　　参照文献[4]，细胞接种于24孔培养板，待长满孔板，用含10mM葡萄糖和10％NBS的PBS培养