γδt细胞及干扰素调节因子在肝细胞癌中的作用研究

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1、复旦大学博士学位论文γδT细胞及干扰素调节因子在肝细胞癌中的作用研究姓名：易勇申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：邱双健2012-04-02中文摘要_—————————————————————————————————————————————一y6T细胞及干扰素调节因子在肝细胞癌中的作用研究原发性肝癌是危害我国国民健康的常见恶性肿瘤之一，在西方国家的发病率也呈上升趋势。全球每年有60．70万人死于肝癌，约55％发生在中国。手术治疗仍旧是肝癌最有效的治疗手段，术后高转移复发率已成为提高肝癌远期疗效的瓶颈。针对这一难题，学者们早期从肝癌细胞本身出发，发现了大量

2、的癌细胞相关基因，并针对这些基因进行了靶向治疗，但均未取得满意的疗效。近年来逐渐重视从肿瘤微环境角度出发，探索各种免疫治疗手段，试图改变肿瘤免疫反应状态，从而探索治疗肿瘤的有效干预手段[1]。然而，由于许多问题没有阐明，目前尚无突破性进展。但对于部分患者而言，肝癌局部有效的免疫反应有助于改善临床进展，甚至提高患者生存率[2]。T淋巴细胞是肿瘤免疫微环境的重要组成部分，许多T细胞亚群在肿瘤免疫中的作用得到了深入研究与认识：细胞毒性T细胞及NKT细胞(NaturekillTcells；NKTcells)发挥抑癌免疫效应，辅助性T细胞向不同方向分化(如Thl、Th

3、2、Thl7、Treg细胞)也可发挥不同的免疫效应[3．5]。总体上，上述这些细胞均属于aJtT细胞(T细胞受体双肽链由0【链及p链构成)，而与之相对应的76T细胞(T细胞受体双肽链由^r链及6链构成)由于在外周血中比例低(仅占成熟T细胞总数的5．10％)，过去研究不受重视。然而，这群细胞在肝脏中特殊富集，可高达局部总T细胞总数的35％，在肝脏中发挥重要的免疫监视作用【6]。yST细胞是一群兼有固有免疫、特异性免疫双重特征的T细胞，具有杀伤与调节双重功能，在局部免疫稳态的维持中发挥着不可替代的作用【7】。其主要免疫特点如下：1)T细胞受体(T-cellrec

4、eptor；TCR)多态性有限，激活不依赖抗原递呈细胞，不受主要组织相容性抗原(majorhistocompatibilityantigen；MHC)限制，因此最初被认为是固有免疫的重要组成部分；2)本身能发挥抗原递呈作用，为幼稚型0cpT细胞的增殖、分化及活化提供共刺激信号，从而介导特异性免疫的诱导、活化[8】；3)在组织中可发挥免疫调节功能[7]。动物实验中表明^r6T细胞可通过直接杀瘤作用、早期大量分泌IFN吖及抑$1]altT细胞中的促癌细胞成分来抑制肿瘤的发生与进展[9】。体外实验证实，T6T细胞能以TCR依赖／非依赖方式中文摘要杀伤多种肿瘤细胞(

5、结直肠癌[10】、肾细胞癌[11]、卵巢癌[12】、骨髓瘤[13】)及肿瘤干细胞[14】。磷酸化抗原能有效地刺激丫6T细胞增殖与活化，增强其杀伤肿瘤细胞的效率[14】。然而，这群细胞在肿瘤微环境中的免疫状态及与其他免疫细胞间的相互作用研究仍是一片空白。TilT细胞是体内丫干扰素(Interferon．．丫；IFN-．丫)的重要来源[15】。IFN吖通过促进异常细胞凋亡，参与肿瘤免疫监视【15，16]，IFN-7'缺陷小鼠(IFN-y受体缺失或IFN-．^，信号转导关键分子STAT-1缺失)化学诱导肿瘤发病潜伏期明显缩短，发病率高于正常小鼠。然而，肿瘤细胞在I

6、FN吖的长期选择压力下发生免疫选择(Immunoselection)，主要表现为被动改变自身免疫原性、通过IFN．Y信号通路相关调节分子变异等改变对IFN吖的敏感性，从而实现肿瘤免疫逃逸。干扰素调节因子(Interferonregulatoryfactors；IRFs)是调节细胞内IFN吖效应的重要转录因子，其中IRF．1介导典型的IFN吖效应，而IRF．2能与IRF．1竞争DNA结合序列，从而为IRF．1提供负反馈抑制信号。肿瘤细胞内II江．1、IRF．2的表达一定程度上反映了肿瘤细胞对内源性干扰素的敏感性。多项临床研究表明，肿瘤细胞内存在IRF．1表达缺

7、失及IRF．2的过表达，且这一特征与肿瘤的恶性表型相关[17．19]。然而，两者在肝细胞癌中的表达特点及与肝癌生物学特性关系尚未阐明。本课题以肝细胞癌免疫微环境为主要研究对象，一、从yST细胞入手，借助组织分离纯化淋巴细胞、流式细胞仪分析丫6T细胞在肝癌局部的浸润及免疫状态，通过流式细胞仪或磁珠分选仪分选yST细胞及调节性T细胞(RegulatoryTcells；Treg细胞)，采用共培养及相关免疫学方法分析Treg细胞对TST细胞效应功能的抑制。我们发现，78T细胞在外周血中比例较低，但在肝脏中大量浸润，而肝细胞癌中浸润却较癌旁肝组织中明显降低；肝细胞癌浸

8、润性TaT细胞表现为功能抑制表型、杀伤功能明显减弱；