猪急慢性弓形虫感染elisa鉴别诊断方法的研究与初步应用

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1、华中农业大学硕士学位论文猪急慢性弓形虫感染ELISA鉴别诊断方法的研究与初步应用姓名：熊冰清申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：赵俊龙201206猪急慢性弓形虫感染ELISA鉴别诊断方法的研究与初步应用摘要弓形虫病(Toxoplasmosis)是由细胞内寄生原虫龚地弓形虫(Toxoplasmagondii)引起的一种人兽共患病。弓形虫病呈世界性分布，在人、家养动物和野生动物中广泛传播，据估计全球有超过1／3的人感染弓形虫。弓形虫感染一般不表现明显的临床症状，大多数被感染者可以终生携带组织包囊而不呈现任何临床症状。然而，对一些免疫抑制病人，例如艾滋病人和恶性肿瘤患者

2、，弓形虫感染却可以由慢性潜伏感染转化为急性感染从而引起严重的后果，甚至威胁患者的生命。人类感染弓形虫主要因为通过食物和饮水摄入了孢子化卵囊或组织包囊，而猪肉正是组织包囊最重要的肉食性来源。中国是养猪业大国，同时也是猪肉消费大国。因此迫切需要一种方法能够对携带组织包囊的牲猪进行快速的鉴别诊断，从而为弓形虫病的预防和控制创造条件。本研究利用原核表达方法获得了两种重组蛋白，即缓殖子特异性蛋白BAGl和速殖子特异性蛋白SAGl，并建立了两种间接ELISA方法rBAGl．间接ELISA和rSAG一间接ELISA。使用这两种间接ELISA方法并结合本实验已经建立的rMIC3．间接EL

3、ISA方法，可以对弓形虫慢性感染的猪进行很好的鉴别诊断。(1)通过RT-PCR扩增获得了Pru株弓形虫BAGl基因完整的CDS序列(690bp)，并构建了BAGl基因的原核表达质粒pET28a(+)一BAGl，实现了BAGl的原核表达，表达产物分子量约32kD，经Western．blot证实此表达产物能够被特异的弓形虫阳性猪血清识别，证明此原核表达产物具有良好的免疫反应性。(2)通过PCR扩增获得了RH株弓形虫SAGl基因，并构建了SAGl基因部分序列(855bp)的原核表达质粒pET28“+)一SAGl，实现了SAGl的原核表达，表达产物分子量约35kD，经Wester

4、n．blot证实此原核表达产物能够被特异的弓形虫阳性猪血清识别，证明此原核表达产物具有良好的免疫反应性。(3)建立了rBAGl．间接ELISA方法，最佳蛋白浓度1：200，最佳血清稀释度1：100，最佳BSA浓度1．00％，最佳封闭时间30min，最佳血清作用时间30min，最佳二抗浓度为1：7000，最佳二抗作用时间60min，阴阳性临界值为OD630=O．38。(4)构建了rSAGl．间接ELISA方法，最佳蛋白浓度l：200，最佳血清稀释度1：100，最佳BSA浓度1．00％，最佳封闭时间60min，最佳血清作用时间30min，最佳二抗浓度为1：6000，最佳二抗作

5、用时间60min，阴阳性临界值为OD630=0．35。(5)利用建立的上述两种检测方法，结合实验室前期建立的rMIC3一ELISA方——_—————————————兰主奎些奎兰三坐望堡主婴窒竺堂垡笙奎一一一一法对湖北省部分地区规模化猪场进行了弓形虫的血清流行病学调查，结果显示感染率高达21．00％，其中慢性感染为12．00％，急性感染为4．30％，这一结果为弓形虫的防治提供了依据。关键词：龚地弓形虫；慢性弓形虫感染；组织包囊；BAGl；SAGl；原核表达；ELISA；鉴别诊断猪急慢性弓形虫感染ELISA鉴别诊断方法的研究与初步应用AbstractToxoplasmosis

6、isanamphixenosiscausedbyanobligateintracellularprotozoanToxoplasmagondii．Zgondiiinfectionisworldwide，anditistransmittedamongalmostallworm-bloodedanimalsincludinghuman，livestockandotherwildanimals．Ithasbeenestimatedthatonethirdofthewordpopulationhasbeeninfected．Usuallytheinfectiondoesnotca

7、useseriousillness，butcreatecystsintissuesofhost．Tissuecystsarelong-livedandnotassociated晰mdisease．However，inimmunocompromisedindividuals，suchasAIDSormalignancies，ruptureoftissuecystsandthetransformationofbradyzoitestotachyzoitesresultsindiseasereactivation．Thisreact