中度低温对大鼠脑缺血诱导的脑组织炎症及外周免疫抑制的效应及机制研究

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1、浙江大学博士学位论文中度低温对大鼠脑缺血诱导的脑组织炎症及外周免疫抑制的效应及机制研究姓名：古丽娟申请学位级别：博士专业：免疫学指导教师：张立煌；赵恒20120603浙江大学博士学位论文摘要中度低温对大鼠脑缺血诱导的脑组织炎症及外周免疫抑制的效应及机制研究浙江大学医学部博士研究生导师中文摘要免疫学古丽娟张立煌教授赵恒教授背景与目的：缺血性脑卒中是世界上发病率最高的疾病之一。脑缺血后，不仅引起受损脑组织剧烈的炎症反应，亦诱发显著的外周免疫抑制。此外，脑卒中还可诱发肺脏、肝脏及心脏等多个脏器损伤。本研究采用永久性大鼠局灶性脑缺

2、血模型研究缺血后脑组织的炎症反应，脑缺血诱导的免疫抑制及对外周脏器的损伤效应；同时，探讨作为强效缺血性脑损伤保护因素的中度低温对脑组织炎症反应，外周免疫抑制及外周器官损伤所产生的效应。方法：分别于370C，30oC条件下夹闭SpragueDawIey(sD)大鼠双侧颈总动脉60分钟，电凝左侧大脑中动脉远端使其永久闭塞以建立大鼠局灶性脑缺血模型(dMCAo)。首先，对大鼠进行神经功能缺损评分，采用TTC染色测量脑梗塞大小。其次，为了解脑缺血后脑组织局部炎症反应情况以及低温对炎症的效应，于脑缺血72小时后，提取脑单个核细胞，计

3、算其总数。进而，采用流式细胞仪分析单个核细胞中各种淋巴细胞亚型(T淋巴细胞、B淋巴细胞，CD4+T淋巴细胞、CD81淋巴细胞、调节性T细胞、NK细胞及NKT细胞)以及S瓜P+单核／巨噬细胞／小胶质细胞绝对数量的改变。之后，采用免疫组织化学进一步评估CD31淋巴细胞在缺血IⅡ浙江大学博士学位论文摘要脑组织的浸润，而免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜则进一步检测了CD68+激活的小胶质细胞／巨噬细胞及MPO+中性粒细胞在脑缺血区的浸润与分布。接下来，实时定量RT．PCR检测脑缺血后5小时、24小时、72小时各种细胞因子(几．1p、

4、TNF．0【，几．4，m．10，m．2、INF吖)、趋化因子(MP．2)及其他炎症介质(INOS、COx．2)在脑组织缺血半暗带的基因表达水平(组别：正常对照组，假手术组，5，24、72小时常温脑缺血组及低温脑缺血组)。为探讨脑缺血诱导的外周免疫抑制，脑缺血对外周器官的损伤效应以及低温对免疫抑制和外周器官损伤所产生的作用，提取并计算外周血、肺脏单个核细胞及脾细胞总数，分析这些组织和器官中淋巴细胞亚型及s瓜P+单核／巨噬细胞绝对值的改变，实时定量RBPcR检测脑缺血后5小时、24小时，72小时上述9种炎症介质在外周器官如：脾

5、脏．肝脏以及肺脏中的基因表达水平。进而，为进一步证实脑缺血可以诱导免疫抑制以及阐明低温的效应，提取大鼠脾细胞，分别于l“g／m1、2．5叫ml及5叫mlConA刺激之下于370C，5％C02孵箱中孵育66小时，之后加入[3H】．Thymidine继续孵育18小时，收集细胞检测脾淋巴细胞增殖(组别：正常对照组，常温假手术组，低温假手术组，常温脑缺血组，低温脑缺血组)。同时，采用大鼠耳廓皮肤皮下注射OVA诱导DTH反应(迟发型超敏反应)作为在体实验来研究脑缺血对细胞介导的免疫反应的效应及低温的影响(组别：正常对照组，常温假手术

6、组，低温假手术组，常温脑缺血组，低温脑缺血组)。结果：永久性夹闭大脑中动脉远端后，大鼠神经功能缺损明显加重，评分超过3分，大鼠出现皮层梗塞，梗塞大小占皮层的百分比达47．36±3．195，而低温治疗组脑梗塞大小为皮层的20．33±3．362％。低温使梗塞明显减小，神经功能缺损明显改善，神经功能缺损评分仅为不到2分。脑缺血后，大量炎症细胞浸润于缺血脑组织，缺血72小时后，缺血侧单个核细胞总数为(O．483±O．0953)×106，相比对侧的(O．173±O．0177)×106，显著增多，其中T淋巴细胞、CD41淋巴细胞及S瓜

7、P+单核／巨噬细胞／小胶质细胞数量也显著增多，而B淋巴细胞、cD81淋巴细胞及NK、NKT细胞呈现增多的趋势。免疫染色进一步证实脑缺血后，缺血脑组织CD31淋巴细胞、cD68+Ⅳ浙江大学博士学位论文摘要小胶质细胞／巨噬细胞及ⅧO+中性粒细胞显著增多。予以低温治疗后，脑组织中单个核细胞总数下降为(0．245±0．0185)×106，而T淋巴细胞、B淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞及s瓜P+单核／巨噬细胞／小胶质细胞浸润数量也明显减少，缺血区CD3、CD68及MPO表达水平也明显降低。脑缺血后，脑组织缺血半暗带儿。lB，TNF．0

8、【、几．10、几．2、INF吖、MP．2，INOS的基因表达水平明显增高，而低温显著抑制了这些炎症介质的表达；几_4及COx．2在缺血脑组织也有表达增高的趋势，但低温对其没有显著影响。脑缺血后，外周血单个核细胞总数为(3．56±0．427)×106，相比常温假手术组的(5．95±O．449)×106，显