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《大鼠脑缺血后脑组织脑红蛋白mrna的动态表达及保护机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、大鼠脑缺血后脑组织脑红蛋白mRNA的动态表达及保护机制研究尹静，张祥建，李俐涛，杨燚（河北医科大学第二医院神经内科，石家庄050000）4脑红蛋白(neuroglobin,Ngb)是2000年由Burmester等[1]德国科学家首先发现的一种新的携氧球蛋白，广泛表达于神经组织,急性缺血的情况下表达上调,在脑的适应性保护中起重要作用。免疫共沉淀实验[2]证明Ngb与Na+,K+-ATP酶β2亚基存在相互作用。现。本研究拟采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术对大鼠缺氧缺血性脑损伤时脑组织中Ngb及Na+,K+-
2、ATP酶α亚基mRNA水平的变化进行动态研究,以期为Ngb所具有的神经保护功能机制的阐明提供线索。1材料与方法1.1实验动物与分组72只成年健康雄性SD大鼠(河北医科大学动物实验中心),体质量50～300g,随机分为3组:大脑中动脉闭塞（middlecerebralarteryocclusion，MCAO）模型组(n=32),氯化血红素（Hemin）干预组(n=32)和假手术组(n=8)。MCAO组和Hemin干预组在模型建立后3、6、12、24h4个时间点各随机分为4个亚组,每个亚组8只大鼠。1.2实验试剂Hemi
3、n（Sigma公司):先用NaOH溶解,再将pH值调至7.3～7.4,浓度为12.5g/L,RT-PCR试剂盒(Promega公司)；,超微量ATP酶测试盒（南京建成生物工程研究所）；）,Bradford蛋白质定量试剂盒（天根生化科技有限公司）。1.3模型的建立参照Longa线栓法复制MCAO模型,经右侧颈总支动脉分叉处插入线栓,阻断右侧大脑中动脉血流；Hemin干预组于术前30min腹腔注射Hemin(50mg/kg)；假手术组仅切开颈部皮肤,分离颈总动脉及分支,不行结扎及栓线。参照Longa评分法取行为学评分在2
4、～4分者进行分析。1.4Na+、K+-ATP酶活性测定低温下取右侧大脑半球梗死区域约0.2g脑组织，制成10%的组织匀浆。Bradford法测定组织蛋白含量，无机磷法测定Na+,K+-ATP酶活性。1.5RT-PCR测定低温下取右侧大脑半球脑组织（去除额极及低位脑干、小基金项目：河北省自然科学基金（C2006000915）作者简介：尹静（1980-），女，河北省南皮县人，硕士研究生，主要从事脑血管疾病方面的研究。E-mail:yinhaoran1980@163.com通信作者：张祥建，E-mail:Zhang6xj@
5、yahoo.com.cn收稿日期：2008-01-06；修回日期：2008-03-26脑）,Trizol提取总RNA,测定其浓度及纯度,进行反转录及产物扩增。引物序列参考GenBank核苷酸序列资料,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成纯化，以β-actin作为内参照。RT-PCR反应条件分别为:Ngb:94℃,2min,1个循环;94℃,30s;55℃,40s;72℃,50s,28个循环;72℃,7min,1个循环;4℃1个循环;Na+,K+-ATP酶α1、α3亚基:94℃,2min,1个循环;95℃,30s;5
6、8℃,30s;72℃,40s,33个循环;72℃,7min,1个循环;4℃1个循环。采用2%琼脂糖电泳观察PCR产物,经凝胶成像处理系统拍摄图像,记录积分光密度值。产物的含量=扩增产物的光密度值/β-actin扩增产物的光密度值×100%。1.6统计学处理所有数据均用(±s)表示。,采用SAS软件析,进行单因素方差分析,多个样本均数之间的两两比较采用q检验。数据由SAS软件分析。2.结果参照Longa评分法取行为学评分在2～4分者进行分析。2.1Na+,K+-ATP酶活性测定3h时三组之间比较无差别时3组之间比较无差
7、别，6h、12h、24h时MCAO组与Hemin组、假手术组比较差异均有统计学意义均有显著性（表1）。表1各组之间Na+,K+-ATP酶活性比较(n=4,±s,U/mgprot)组别3h6h12h24hMCAO组4.565±0.7764.384±0.849a3.889±0.525a3.002±0.442aHemin干预组5.539±1.3666.064±0.699b5.057±0.610b4.793±1.310b假手术组5.612±0.6155.612±0.6155.612±0.6155.612±0.615a:P﹤0
8、.05,与假手术组比较;b:P﹤0.05,与MCAO组比较2.2RT-PCR分析2.2.1凝胶电泳及图像分析结果Ngb、Na+,K+-ATP酶α1、α3亚基、β-actin扩增后的产物片段与设计相符（图1），测量电泳后的IOD值,分别计算与β-actin的IOD值比值（表2～4）。42.2.2缺血后Ngb、Na+,K+-ATP酶α1、α3亚基m
